04第四讲蛋白质结构解析技术(一)

第三章蛋白质结构解析技术结构——功能一级结构——高级结构解析蛋白质结构破译折叠密码第四讲蛋白质结构解析技术（一）1.氨基酸序列分析2.X-射线衍射技术3.核磁共振4.质谱技术5.结构分析的其它方法①现代光谱技术②三维电镜重构技术③动力学全局研究技术UV-Vis、IR、荧光、CD、激光拉曼蛋白质结构和构象；构象变化过程；•如：蛋白质折叠过程中间态形成的时间尺度和机制.•二级结构形成、卷曲过程，•变性和复性过程及机制。主要内容是结构与功能研究的基础第一节蛋白质氨基酸序列分析技术主要内容•化学法•基因方法•蛋白质分子中二硫键和酰胺基位置的确定•蛋白质测定新技术一级结构测定的意义：寡核苷酸探针的设计与制备cDNA推导氨基酸序列提供依据重组DNA产生的蛋白指纹分析蛋白质的完整结构鉴定确定翻译后修饰的位点决定簇的定位二硫键的确定一、蛋白质测序的研究历史1947采用部分水解的方法试图测定蛋白质的氨基酸序列Consden等利用色谱技术成功测定了短杆菌肽S6的氨基酸序列Sanger首次测定了牛胰岛素的一级结构（由51个氨基酸残基组成）Spackman、Stein、Moore制造了自动化的氨基酸分析仪，使氨基酸定量分析进入了一个崭新的阶段Edman推出第一台全自动测序仪195819551940年前1967N-末端氨基酸的测定方法（主要5类）1、二硝基氟苯法（DNFB法、Sanger法）2、二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl法）DNS-氨基酸呈荧光3、异硫氰酸苯酯法（PITC法）4、DABITC法（甲氨偶氮苯基异硫氰酸苯酯），形成的DABIH—氨基酸呈桔黄色（有颜色）5、氨肽酶法N-末端测定的方法——奠定了序列测定方法发展基础牛胰岛素（51aa）的一级结构Sanger首次(DNFB法)测定了牛胰岛素的一级结构——Sanger法（测定蛋白N末端的方法）二、序列测定方法——化学方法（一）N端测序法应用最广的N端顺序测定法大多仍以Edman降解原理为基础设计。利用化学试剂和控制反应条件，从N端开始，将肽链逐步降解，进行氨基酸序列的测定的方法。1、Edman降解法——异硫氰酸苯酯（PITC）法特点：可以测定氨基酸的排列顺序（包括N端分析）。适用于手工操作，也可设计自动化测定仪器（1）原理：四点：①异硫氰酸苯酯(PITC)偶联→②ATZ-氨基酸裂解→③PTH-氨基酸转化→④PTH-氨基酸的鉴定偶联：自由α-氨基与异硫氰酸苯酯(PITC)试剂偶联，与其紧挨的第二个残基的键合力大大减弱，很容易断裂。裂解：在无水条件下酸（F3CCOOH）裂解，形成苯氨基噻唑啉酮衍生物（ATZ-氨基酸）和失去末端氨基酸残基的多肽，又可与PITC进行偶联反应，下一轮降解。转化：ATZ-氨基酸不稳定，三氟乙酸水溶液（25%）可转化成稳定的PTH-氨基酸。PTH-氨基酸的鉴定：可以通过薄层层析、气相色谱、高效液相色谱及质谱等各种手段进行分析。乙内酰苯硫脲氨基酸(PTH－氨基酸)。PITC试剂ATZ-氨基酸•单向纸层析氨基酸鉴定——PTH-氨基酸与标准氨基酸（PITC试剂反应）对照•双向纸层析•薄层层析（TLC）•高效液相色谱（HPLC）（highperformanceliquidchromatography）（2）氨基酸序列分析仪器以Edman法测序，手工操作繁琐，工作量大根据Edman降解的原理——自动化分析仪器自70年代初全自动序列仪诞生以来，经过了一系列更新换代，仪器日趋灵敏、快速。灵敏度达0.1pmol蛋白3种代表性的测序仪器简单介绍如下：①液相旋转杯序列仪最初的自动化仪器，对自动化测序意义很大。测定程序：整个仪器的“核心”部分是一个反应杯，它由一个马达带动并有调速控制。蛋白质或多肽样品经导管注入反应杯，通过旋转离心力被均匀地涂在杯壁上，形成一层薄膜，其厚薄可由转速控制。反应试剂和溶剂分别通过导管进入反应杯，与杯内薄层上的样品的N端自由氨基进行Edman反应；降解下来的ATZ—氨基酸衍生物通过另一导管引出并收集；再将ATZ氨基酸→PTH氨基酸→鉴定；洗涤反应杯，依次循环分析。特点：该仪器样品流失较大，样品消耗量大，目前已很少使用。②固相序列分析仪发展的动力和原因：克服液相旋转杯分析仪的缺点。•多肽不易吸附旋转杯上，样品流失较大；原理：蛋白质C端羧基共价固定在惰性载体上，进行Edman降解。特点：样品与载体共价结合，洗涤和抽提等过程不会丢失样品，增加循环次数。缺点：（1）若多肽中其它残基的羧基与载体结合，影响测定。如：酸性氨基酸残基（Asp、Glu）（2）测定效率低3-氨基丙基玻璃N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基玻璃惰性载体成功的关键是肽段的固定，目前采用C端α-羧基固定法，重复法高，高丝氨酸内酯法及双异硫氰酯法(DITC)最好，固定率可达90-95%。③气相蛋白序列分析仪弹筒型玻璃反应室反应室容积0.05ml，代替液相序列仪中的旋转玻璃杯，用一种惰性聚合物“polybrene”固定样品。多肽链与气态试剂反应，完成Edamn降解。优点：灵敏度高，耗费样品量少，通常仅需10~100pmol；试剂和溶剂消耗少，大约是液相序列仪的1／10，降低了费用；缩短了每步降解循环时间，提高了分析效率。趋势：灵敏度不断提高气相蛋白序列分析仪（3）Edman方法改进①DABITC法：1976年，（华裔科学家）张瑞耀提出•试剂：甲氨偶氮苯基异硫氰酸苯酯替代了异硫氰酸苯酯（PITC）–DABITC：4-N,N-对甲氨基偶氮苯-4’-异硫氰酸酯•原理：–与PITC相似，形成有色产物DABIH—氨基酸，呈桔黄色–也称为有色的Edman降解法，氨基酸鉴定无需染色，肉眼可分辨•特点：–灵敏度很高，分析小肽段只要几个nanomole样品即可。–但DABITC试剂与多肽N端aa耦合率低（20%-30%），测序干扰大！如何解决？②DABITC—PITC两种方法耦合，更加灵敏可靠。–适用于：液相还是固相，手工还是自动方法，效果良好。③异硫氰酸酯进行35S标记：使分析样品更向微量化方向发展。④二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl法）•荧光剂—DNS-Cl，与肽链N端氨基反应生成DNS-肽•经酸水解，N-末端残基形成DNS-氨基酸，检测灵敏度提高310倍。•乙酸乙酯抽提，层析鉴定，DNS-氨基酸于360nm或280nm处产生强烈荧光，根据荧光点位置确定N端氨基酸。6MHCl，110℃水解过夜DNS-脯氨酸70%被破坏。Gln→Glu，Asn→AspTrp及其DNS衍生物完全被破坏(可用巯基乙烷磺酸真空下水解)特点：不能连续降解，适用于N末端分析N(CH3)2SO2ClH2NCHCROHNCHCROSO2N(CH3)2+水解N(CH3)2SO2HNCHCROOH+氨基酸丹磺酰氯多肽N-端丹磺酰N-端氨基酸丹磺酰氨基酸（n-1）肽荧光？⑤DNS—Edman测定法两种方法的结合DNS法，灵敏的高，但不能连续进行Edman降解法N肽DNS-ClN末端氨基酸测定Edman降解除去N末端氨基酸水层（n-1）肽乙酸乙酯层（N末端氨基酸衍生物）DNS-ClN末端氨基酸测定Edman降解除去N末端氨基酸DNS—Edman测定流程示意图思考？为何要创新很多方法？什么样的方法能延续下去？（4）氨基酸自动序列仪的使用方法依据Ednan原理，氨基酸自动测序仪，序列分析加快测序仪发展方向：微量化、自动化加样量达到微量：10-9—10-12mol水平推出从进样到色谱分析一体化分析仪举例：Shimadzu（日本岛津）公司PPSQ-21A氨基酸自动测序仪工作原理：Ednan降解，产物乙内酰苯硫脲氨基酸（PTH-氨基酸），柱前衍生的液相色谱（HPLC）分析。工作流程固定样品固定将蛋白固定在高聚纤维素上，在放在能固定蛋白的聚偏氟乙烯（PDVF）膜上，进行Edman降解。反应器耦合以N-甲基哌啶水/甲醇（TMA）气雾环境让蛋白末端氨基酸与PITC反应，生产PTC-肽反应器终止反应用乙酸清洗出去多余的试剂和副产物反应器裂解无水TFA溶液，将PTC-肽裂解为ATZ-氨基酸和（n-1）肽，排出并洗涤转换器转换反应采用25%TFA溶液将ATZ-AA转化为PTH-AA转换器提取在转换器提取游离的PTH-氨基酸样品进样进样用乙腈溶液溶解PTH-氨基酸，并进样到HPLCHPLC分析分离鉴定反向HPLC分离PTH-氨基酸，并检测数据处理数据分析显示和处理数据，确定PTH-氨基酸，并进行定量和回收率计算（5）影响N端Edman反应裂解率的因素在测序中，即使N端很均一的蛋白质(第一个循环出现单个氨基酸残基)，经过十几个循环后背景明显不及第一个残基清晰。原因：Edman反应是一个化学过程，在其偶联、裂解、转化等步骤都有可能发生一些副反应，从而影响最终裂解效率。三氟乙酸除了裂解作用外，可与Ser和Thr上的-OH反应，继而部分封闭Ser和Thr的N端α-氨基，导致Ser和Thr时产率突然降低。Ser和Thr的PTH-衍生物部分转化成其他产物，造成产率降低。偶联试剂PITC本身也将发生副反应，形成一些“杂质”。（6）N端测序前样品处理纯度鉴定（97%）脱盐疏基修饰去除N端封闭的基团（酸水解，酶处理）（二）C端测序法•虽然自动化N端测序技术日趋成熟，•但仍有不少问题需借助C端序列分析来解决（？）•C端测序优势：尤其适合于基因重组蛋白是否正确表达的鉴定（Why？）大规模生产时的质量控制、N端封闭蛋白的分析DNA探针或引物的设计。（不做详细讲述，感兴趣者自己阅读学习）1、原理（C端分析）基于与N端Edman降解类似的原理，•采用化学试剂与蛋白质和多肽的α-COOH反应，•反应后的C末端衍生物被切割下来，•通过HPLC系统进行分离分析。已有自动化的C端序列分析仪(1)活化C端的自由羧基与乙酸酐反应生成混合酸酐，混合酸酐再环化成聚噁唑酮，在四丁基铵硫氰酸盐的作用下，转化为乙内酰硫脲(TH)。而侧链上的羧基形成的混合酸酐则难以成环。2、C端序列分析程序六个步骤、羧基活化→侧链羧基保护→烷基化TH–肽→侧链羟基保护→断裂形成ATH-AA→AA分析(2)侧链羧基的酰胺化保护侧链羧基形成混合酸酐，与哌叮硫氰酸盐（piperidinethiocyanate）进一步作用形成酰胺，以保护侧链羧基。(3)烷基化C末端环化成的乙内酰硫脲（TH）衍生物较为稳定而不易被切割，产率不高。选择性地烷基化修饰硫原子，形成烷基化-TH(ATH)衍生物，裂解产率将大大提高。(4)修饰侧链羟基（保护）Thr和Ser残基的侧链上具有羟基羟基不稳定，会干扰测序，需要修饰。乙酸酐将羟基乙酰化，但反应不完全。N-甲基咪唑（NMI）和乙酸酐共同作用，将Thr和Ser的羟基乙酰化。(5)裂解和衍生C末端ATH衍生物在酸性条件下与硫氰酸盐反应而被裂解生成ATH-氨基酸。新的C末端自动环化形成乙内酰硫脲（TH），而不必重新活化。整个测序过程只需在开始时对C端进行一次性活化，并修饰Asp和Glu侧链羧基，以及Thr和Ser的羟基。(6)ATH-AA分析（常规分析）小结——C末端测序程序羧基活化→侧链羧基保护→烷基化TH–肽→侧链羟基保护→断裂形成ATH-AA→AA分析测定C端第一个和第二个氨基酸工艺的区别3、C末端蛋白质序列仪可由N端序列仪改装而成，不同之处主要在于:(1)反应所用的试剂不同，两者不兼容，否则易堵塞管道。(2)C端序列仪：–所有的化学反应均在弹筒型反应室中进行，–切割下来的ATH-AA仅在转化腔内干燥和溶解后–即可进入HPLC系统分离分析。(3)N端测序仪：–ATZ-AA需在转化腔中转化为PTH-AA。4、C端测序样品前处理纯度鉴定脱盐疏基修饰ε-氨基的衍生5、影响C端测序反应产率的因素不同的氨基酸的反应产率不同，图谱分析比N端测序复杂。C端测序副反应较多，最高起始产率仅为20%，GluAspSerThr等残基的产率更低。若C端富含这几