05第5章体外分析技术.

第5章体外分析技术待测物质浓度与检测手段临床化学分析10-1210-910-610-310-0pg/mLng/mLmg/mLmg/mLg/L免疫分析治疗药物甲状腺激素生殖激素过敏素癌症标志物感染性疾病维生素血清蛋白常量微量超微量现代医学的发展疾病诊断的革新可在没有任何临床症状，而病人体内发生1.基因表达异常；2.受体分布异常或受体功能改变；3.器官代谢异常；4.激素水平异常酶、神经递质……等异常，可早期发现。体外分析和影像学的发展起了很大作用例如癌症的早期诊断Berson&Yalow•1960年美国的Berson和Yalow将核技术与免疫学技术结合建立了放射免疫分析法。•首先用于测定血浆胰岛素浓度，由于该法对医学的巨大贡献，1977年Yalow获得了NobelPrize。YalowBersonHistoryreviewRadioimmunoassay放射免疫分析法的创立集中了放射性核素示踪技术的高灵敏度和免疫发应的高特异性开创了医学生物学超微量分析方法使人体内微量生物活性物质的测量成为可能对现代医学的发展起到推动作用•R：放射性核素标记抗原–高灵敏（10-9~-15g/ml）–探测待测物上的标记信号(标记物的放大效应)I：免疫学反应高特异以抗体为结合剂B:标记抗原与非标记抗原竞争与同种抗体结合定义体外分析技术是以放射核素标记（或其他非放射性标记）的配体为示踪剂，以配体和结合体的结合反应为基础，在试管内进行的微量生物活性物质的检测技术。体外分析技术是结合了放射性核素的高灵敏度和特异性结合反应的高特异性的一种超微量分析技术，具有灵敏度高、特异性强、精密度好、应用面广、方法简便等优点。体外分析技术定量手段放射性测量技术酶定量技术化学发光定量技术生物学基础特异性结合反应：抗原-抗体的免疫结合反应；配基-受体的结合反应；底物-催化酶之间的酶促反应；结合体：抗原--抗体激素--激素结合球蛋白受体--配体体外分析技术体外放射分析体外非放射分析放射性竞争结合分析放射性非竞争结合分析放射免疫分析(RIA)免疫放射分析酶免疫分析化学发光免疫分析荧光免疫分析(IRMA)(EIA)(CLIA)(FIA)早期的放射免疫技术是基于竞争性结合反应原理的放射免疫分析(RIA)，稍后又发展了非竞争性结合的免疫放射分析(IRMA)。该类技术具有灵敏度高、特异性强、重复性好、样品及试剂用量少、操作简便且易于标准化等优点，广泛应用于生物医学研究和临床诊断领域中各种微量蛋白质、激素、小分子药物和肿瘤标志物的定量分析，对相关学科的发展起到了极大地推动作用。放射免疫分析法在体外条件下,利用Ag与定量的*Ag对限量的特异性Ab的竞争结合反应，通过测定放射性复合物的量来计算出Ag量的一种超微量分析技术。基本原理Ag-Ab+Ag*AgAbAg++*Ag-Ab+*Ag(B)(F)*Ag与Ag免疫活性相同*Ag＋AgAbAg=*Ag,AgAb=*AgAbAg*Ag,AgAb*AgAbAg*Ag,AgAb*AgAbAg*AgAb*AgAbAgAb*Ag++++++++++++++++++++Ag2550100200400800定量*Ag定量AbB%=B/(B+F)B1%B2%B3%B4%B5%B6%123456浓度+B%标准曲线常用的有B%（B/B+F)，B/F，F/B，B0/B等这些反应变量都可以用作纵坐标来对应标准抗原的浓度作标准曲线，选用的反应变量不同，标准曲线的形状也不同。但是这些标准曲线都是反映的反应变量对应标准抗原浓度变化而变化的函数关系。操作基本步骤•加样：加样总体积要保持一致，所处的介质环境也要一致。•孵育：根据不同的分析对象孵育的温度和时间不同，一般是37℃。•分离：选择好的分离方法分离游离抗原和抗原－抗体复合物。•测量：测量游离或结合物部分的放射性。•数据处理：绘制标准曲线和待测物浓度的计算。基本方法基本试剂1.抗体2.标记抗原3.非标记标准抗原（标准品）2.标记抗原1）比活度和放化纯度足够高比活度——每微克抗原上标记放射性核素的千贝可数（KBq/μg）放化纯度——具有免疫活性的标记抗原占总放射性的百分数。90%2）半衰期足够长3）保持原有抗原的特性大分子：125I小分子：3Hor125I放射免疫技术－常用的放射性核素125I3H射线γβ理化性活泼差核素丰度90%－半衰期60.2d12.3y标记方法简单复杂标记设备低廉昂贵测量条件简单复杂常用标记核素125碘-标记物的制备－标记125I-化学或酶促反应，将放射性负电碘离子氧化成碘原子或正电碘离子，通过取代反应置换被标记物分子上的氢原子。125I或125I+125I-标记物（混合物）Ch-T、LPO氧化取代反应放射免疫技术－标记物制备125碘-标记物的制备－纯化凝胶过滤法离子交换层析法聚丙烯酰胺凝胶电泳高效液相色谱法聚合、损伤物标记蛋白游离125I3.非标记抗原（标准品）化学结构、免疫活性与被测抗原相同高纯度B和F的分离1.第一类2.第二类双抗体沉淀法固相第二抗体法（洗涤）+AgAb(1)Ab(2)Ab(2)Ab(1)Ag可溶性复合物可沉淀复合物试管试管分离方法的要求分离完全、快速。不影响免疫反应的平衡，即是要求在分离过程中不使抗原-抗体复合物解离或形成新的复合物。受环境因素（温度、pH值等）的影响小。操作简便，分离剂来源丰富、价廉。测量、数据处理晶体闪烁计数器包括了NaI闪烁晶体、光电倍增管以及计数器测量的放射性信号是仪器输出的电脉冲数：每分钟计数(cpm)计算参数cpmB/T(%)F/T(%)B/F(%)B/B0(%)拟合注：T即是B与F的总和RIA小结1.灵敏度高2.特异性好3.精确的定量4.方法操作简便免疫放射分析法*Ab+Ag-*Ab+*Ab（IRMA）B%Ag（B）（F）在体外,利用Ag与过量的*Ab的非竞争性结合反应，通过测定放射性复合物的量来计算出Ag量。标记抗体，抗体是过量的。IRMA与RIA工作原理的主要区别RIAIRMA竞争性抗原抗体结合反应非竞争性抗原抗体结合反应采用标记抗原采用标记抗体三种主要反应试剂二种主要反应试剂所用抗体是限量的所用抗体是过量的*AgAb的量与待测Ag的量呈负相关Ag*Ab的量与待测Ag的量呈正相关反应到达平衡慢反应到达平衡快非特异结合主要影响高剂量区非特异结合主要影响低剂量区低剂量区有不确定因素低剂量区无不确定因素单位点IRMA先用过量标记抗体与待测抗原进行反应，形成抗原抗体复合物；用固相抗原结合未结合标记抗体并将其分离,测定上清液的放射量双位点IRMA先用固相抗体与抗原结合，再用过量的标记抗体与抗原的另一决定簇结合，形成固相抗体-抗原-标记抗体复合物，洗弃剩余标记抗体，测固相上放射性。B%B%拟合的标准曲线拟合的NSB拟合的标准曲线拟合的NSBIRMA的标准曲线及非特异结合曲线RIA的标准曲线及非特异结合曲线放射免疫分析技术的灵敏度高、特异性强、精密度好,常用于各种激素、微量蛋白质、肿瘤标志物和药物等微量物质的测定。但由于放射污染和危害，常用核素半衰期短，试剂盒稳定期不长等诸多不足,RIA将逐渐被取代。放射免疫分析技术的应用非放射性标记免疫分析技术酶标记免疫分析技术化学发光免疫分析技术时间分辨荧光免疫分析技术酶标记免疫分析技术用酶分子代替放射性核素标记抗原或抗体，进行竞争性或非竞争性免疫分析的技术。其中应用最多的就是酶联免疫吸附分析法（ELISA）。是结合了抗原抗体高特异性和酶促反应的高敏感性的检测技术。ELISA方法是用酶分子标记抗体，进行与IRMA相似的夹心法免疫反应，反应结束后分离结合部分和游离部分，利用结合部分上的酶分子的催化活性将底物转化为特定的颜色，用分光光度计测定，颜色的深浅和酶量成正比，而酶量又和复合物的量成正比。常用的酶是辣根过氧化物酶，底物是四甲基联苯胺(TMB)，反应后显黄色。化学发光免疫分析技术化学发光免疫分析技术是以化学发光物质代替放射性核素作为示踪物的超微量分析技术。化学发光物质在氧化剂或催化剂的作用下能形成激发态产物，并在退激时将能量转化为光子的物质。1.化学发光免疫分析是用化学发光物质作为标记物，标记抗原或抗体，反应以后，利用碱性条件下化学发光物质在氧化物作用下可以发生单光子放射。检测光子的数量就可以反映复合物的量。常用的化学发光物质是异鲁米那和吖啶酯。2.化学发光酶免疫分析和ELISA相似，用碱性磷酸酶标记抗体，经夹心法免疫反应后，带有酶的复合物作用于特殊的底物--金刚烷，使底物发射出光子。此法光子发射持续时间较长，可靠性比较好。时间分辨荧光免疫分析技术（time-resolvedfluoroimmunoassay）时间分辨荧光免疫分析采用稀土元素标记抗体，利用时间分辨荧光仪特定的延迟时间测量，获得稀土元素的特异荧光信号，同时消除非特异性荧光物质的干扰。标记物为具有独特荧光特性的稀土金属—镧系元素镧系元素共有15种，应用在时间分辨荧光免疫技术种有四种钐（Sm），铕（Eu），镝（Dy），鋱（Te）镧系元素荧光重要特点：1.极长的荧光衰退时间铕：730000ns，钐：50000ns，一般荧光物质：10ns2.200nm的Stokes位移铕：激发光340nm，发射光613nm荧光素的Stokes位移为273nm3.狭窄的发射峰4.解离-增强技术可使其荧光性提高100万倍时间分辨荧光免疫分析技术（time-resolvedfluoroimmunoassay）基本原理镧系元素（15）：铕（Eu），钐（Sm），镝（Dy），鋱（Te）Eu+EuEu+增强液+Eu“解离增强镧系荧光免疫分析”时间分辨荧光检测的基本原理示意图荧光衰退时间铕：730000ns钐：50000ns一般荧光物质：10ns铕的荧光TrFIA的特点1.最大限度提高测量方法的灵敏度2.有与RIA相似的特异性和精密度3.可同时测定两种以上的抗原4.无辐射污染质量控制就是使用合适的方法以检查、表示和消除来自试剂药盒和测量体系的误差，并使这种误差降低到某一允许水平。具体作用有：1．检查误差的程度，决定测定结果的取舍。2．识别误差的来源并消除其原因。3．改进测定方法的设计以提高质量。体外标记免疫分析的质量控制1.精密度（precision）同一测定方法在同样下对检测样品进行多次重复测定时，所得测定结果之间的一致性变异系数（CV）一般要求变异系数15%~20%2.准确度（accuracy）准确度=（测定值-真实值）/真实值×100%1)(NXXSDIXSDCV3.灵敏度（sensitivity）方法的最小可测量，即在待测样品中能够检出靶物质的最小浓度6.稳定性（stability）使用期内测定结果具有连续性和可比性，性质稳定4.特异性（specificity）反映分析方法中所用抗体对被测物质的专一性总结体外分析的发展方法设计的改变：竞争结合分析非竞争结合分析，代表方法是免疫放射分析标记物的改变：放射性核素荧光、酶、化学发光、稀土元素结合体的改变微生物——RMA酶——REA受体——RRA特异结合蛋白——CPBA改变结合体对放射性技术AgAg-AbRIA+Ab免疫学技术※Ag※Ag-Ab改变标记物第一阶段第二阶段第三阶段小分子半抗原联接125I单克隆技术固相技术药品化Kit理论与实践上更丰富更完善的RIA1.可测物达300多种2.涉及多个临床与基础学科3.RIA显像4.RIA治疗荧光—FIA—IRMA化学发光—CIA酶—EIA