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酶工程的研究进展及应用摘要酶工程是现代生物技术的重要组成部分,它作为一项高新技术将为工业的发展起重要推动作用。本文主要综述了人工合成酶和模拟酶,核酸酶与抗体酶,以及非水系酶新酶种的理论和技术研究的最新进展及酶工程在各工业中的应用,对酶工程的发展前景进行了探讨。关键词：酶工程人工合成酶核酸酶应用一前言酶工程是研究酶的生产和应用的一门新兴学科,它的应用范围已遍及工业、农业、医药卫生行业、环保、能源开发和生命科学等各个方面。作为工业应用来说,主要目的就是利用酶的催化作用,在较为温和的条件下,如低温、低压等,就可高效地将反应物转化为产物。但目前工业上直接利用酶制剂时还存在一些缺点,如稳定性差、使用效率低,不能在有机溶剂中使用,寿命不长等,造成了使用酶的成本升高.世界上围绕着解决这些问题开展了大量的研究.本文通过查阅大量资料,对酶工程的研究进展及应用进行简述二本论2.1酶工程的最新研究进展2.1.1人工合成酶和模拟酶[1－2]人工合成酶在结构上具有两个特殊部位,一个是底物结合位点,一个是催化位点。业已发现,构建底物结合位点比较容易,而构建催化位点比较困难。2个位点可以分开设计。但是已经发现,如果人工合成酶有一个反应过渡态的结合位点,则该位点常常会同时具有结合位点和催化位点的功能。人工合成酶通常也遵循Michaelis－Menten方程。例如.高分子聚合物聚-4-乙烯基吡啶-烷化物,具有糜蛋白酶的功能,含辅基或不含辅基的高分子聚合物,具有氧化还原酶、参与光合作用的酶和各种水解酶等功能。在模拟酶方面,固氮酶的模拟最令人瞩目。人们从天然固氮酶由铁蛋白和铁钼蛋白2种成分组成得到启发,提出了多种固氮酶模型。如过渡金属(铁、钴、镍等)的氮络合物,过渡金属(钒、钛等)的氮化物,石墨络合物,过渡金属的氨基酸络合物等。此外,利用铜、铁、钴等金属络合物,可以模拟过氧化氢酶等。近来,国际上已发展起一种分子压印(molecularimprinting)技术,又称为生物压印(bioimprinting)技术。该技术可以借助模板在高分子物质上形成特异的识别位点和催化位点。目前,此项技术已经获得广泛的应用。例如,模拟酶可以用于催化反应,分子压印的聚合物可用作生物传感器的识别单元等。2.1.2核酸酶和抗体酶[3～5]近年来,人们发现除去蛋白质具有酶的催化功能以外,RNA和DNA也具用催化功能。1982年Cech发现四膜虫的26SrNAD的前体,在没有蛋白质存在的情况下,能够进行内含子的自我剪接,形成成熟的rRNA,证明RNA分子具有催化功能,并将其称为核酸酶(ridozyme,有人译为核酶)。1995年Cuenoud又发现某些DNA分子也具有催化功能。这就改变了只有蛋白质才具有催化功能的传统观念,也为先有核酸,后有蛋白质提供了进化的证据。进一步的研究发现核酸酶的一种多功能的生物催化剂,不仅可以作用于RNA和DNA,而且还可以作用于多糖、氨基酸酯等底物。核酸酶还可以同时具用信使编码功能和催化功能,实现遗传信息的复制、转录和翻译,是生命化过程中最简单、最经济、最原始的、催化核酸自身复制和加工的方式。核酸酶具有核酸序列的高度特异性。这种特异性使核酸酶具有很大的应用价值。只要知道某种核酸酶的核苷酸序列,就可以设计合成催化其自我切割和断裂的核酸组成。根据这些基因组的全部序列,就可设计并合成出防治有这些病毒引起的人、畜和植物病毒病的核酸酶,如能够防治流感、肝炎、艾滋病和烟草花叶病等。核酸酶也可以用来治疗某些遗传病和癌病。核酸酶还可以用作研究核酸图谱和基因表达的工具。抗体酶的催化效率远比模拟酶高。同时,从原理上讲,只要能找到合适的过渡态类似物,几科可以为任何化学反应提供全新的蛋白质催化剂———抗体酶。目前抗体酶催化的反应、闭环反应,还能催化合成反应、交换反应、闭环反应、异构化反应、氧化还原反应等。此外,与模拟酶相比,抗体酶已经用于酶作用机理的研究,手性药物的合成和拆分,抗癌药物的制备。目前人们正致力于进一步提高抗体酶的催化效率,期望在深入了解酶的作用机理,以及抗体和酶的结构和功能的基础上,能够真正按照人们的意愿,构建出具有特定催化活性和专一性的、催化效率高的、能满足各种用途需要的抗体酶。2.1.3非水系酶[6～7]众所周知,酶不能改变反应的平衡常数(Keq)。但是,利用水-有机溶剂两相系统,可以引起实践上很有用的“表现”Keq很大的改变。前已述及,在非水系统内酶的稳定性提高。水溶性更高、亲水性更强的酶的稳定性,似乎取决于微环境内存在水的薄层,大约几个水分子厚，水的数量非常微小，每个酶分子需要50～500个水分子。酶也可以在几乎完全无水的状态下起催化作用。在这样微小的、不含游离氢离子的环境中的pH,是无法直接测量和控制的。然而,酶有一种“记忆”功能。当酶从水溶液中向有机溶剂中转移时，似乎能够“记住”,即保留住它最后所处环境中的pH,以及在该pH的功能。如果酶结合的水被除去,或被易于与水混溶的有机溶剂稀释,则酶一般会失去活性。但是,在不发生失活的条件下,只要有极微量的水以及与之有关的水的活度的降低,会大大降低酶热失活的速度。这一现象可以用于绝大多数酶。例如,猪胰脏脂肪酶在含有0.02%水的三丁酸甘油酯内,100℃时的半衰期为12h；当水分为0.8%时,凌晨衰期下降到12min。而在100%的水中,酶将立即失活。此外,在水-有机溶剂两相系统内,水的冰点下降,这样,就可以在非常低的温度下,使用对热特别不稳定的酶。降低水的活度可以使酶分子更具有刚性,这就可能影响到酶的Km和Vmax。在极端情况下,可能引起酶的催化功能的改变。以往,人们都是从酶的最适pH的水溶液中回收酶。然后,将其研磨成粉末。再分散在合适的有机溶剂中,制成酶的悬浮液,以便在水-有机溶剂两相系统中进行酶的催化反应。近来Klibanov为首的研究组又探索出一种新方法,可以使酶溶解而不是悬浮在有机溶剂中。而且,找到很多能够溶解酶有机溶剂,并阐明了导致有机溶剂中较高蛋白质浓度的规律。由此,可以进一步研究溶解在有机溶剂中的天然酶的结构和催化特性。因而,必将大大拓宽酶在非水系统中的应用范围。近来,核磁共振、x-射线衍射和傅立叶变换红外光谱的研究表明,在非水相中,酶分子结构中α-螺旋含量减少,β-折叠含量增加,二级结构的有序性增加,因而,提高了酶的稳定性。目前,非水系统中酶的催化作用已广泛地用于药物、生物大分子、肽类、手性化合物化学中间体和非天然产物等有机合成,引起人们的极大的关注。2.2酶工程的应用2.2.1酶工程技术在医药工业中的应用1、应用酶工程生产抗生素应用酶工程可以制备青霉素酞化酶、头抱菌素酞化酶、头抱菌素、头抱菌素酞化酶、青霉素酞化酶、脱乙酸头抱菌素、头抱菌素乙酸醋酶,近年来还进行固定化产黄青霉青霉素合成酶系细胞生产青霉素的研究,合成青霉索和头抱菌素前体物的最新工艺也采用酶工程的方法。2、应用酶工程生产维生素制造2一酮基一L—古龙糖酸【山梨糖脱氢酶及L一山梨糖醛氧化酶】、肌醇【肌醇合成酶】、L—肉毒碱【胆碱脂酶】、CoA【CoA合成酶系】等。由山梨醇和葡萄糖生产维生素及丙烯酸胺的生产也采用酶工程的方法。2.2.2酶工程技术在环保中的应用微生物在环境治理方面发挥了巨大的作用,各种微生物酶能够分解糖类、脂肪、蛋白质、纤维素、木质素、环烃、芳香烃、有机磷农药、氰化物、某些人工合成的聚合物。人们研究的用于环境治理的酶包括如下几类:处理食品工业废水，如淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、脂肪酶、乳糖酶、果胶酶、几丁质酶等;处理造纸工业废水，如木聚糖酶、纤维素酶、漆酶等；处理芳香族化合物,如各种过氧化物酶、酪氨酸酶、萘双氧合酶等；处理氰化物,如氰化酶、腈水解酶、氰化物水合酶等；处理有机磷农药,如对硫磷水解酶、甲胺磷降解酶等，处理重金属，如汞还原酶、磷酸酶等；还有能够完全降解烷基硫酸酯和烷基乙基硫酸酯或部分。2.2.3酶工程技术在食品工业中的应用应用酶工程技术生产食品添加剂，如海藻酸钙包埋乳酸菌生产乳酸，采用从豆类提取的脂肪氧合酶或均质的植物组织，如莴苣叶可将亚油酸转化成具有新鲜、青香气息的顺-3-己烯醇和反-2-己烯醇,采用玉米麸质粉为主要原料，经α-淀粉酶液化、水解、脱色脱臭及干燥制得新型食品添加剂玉米蛋白发泡粉；应用酶工程技术进行功能食品成分的开发，可生产活性多糖、低聚糖、活性肽及氨基酸、核苷酸和糖醇等，如动物软骨经木瓜蛋白酶处理提取硫酸软骨素，壳聚糖经壳聚糖酶处理制得低聚壳聚糖，卵蛋白经自身酶法脱糖后，加入蛋白酶进行酶解制成卵白肽；酶工程技术在食品加工中有广泛应用如以玉米淀粉为原料，在糊化时加入耐热α-淀粉酶，采用酶脱支反应等手段改变淀粉原有的分子结构并重新结晶，可以提高产品中抗性淀粉的含量，果胶酶可以提高果汁澄清度,葡萄糖氧化酶用于果汁脱氧化，超氧化物酶用于乳清脱色等。2.2.4酶工程技术在农业中的应用1、酶工程应用于农产品的深加工利用α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和葡萄糖异构酶的催化功能，以玉米淀粉等为原料生产高果糖浆等。乳制品加工则需要用凝乳酶和乳糖酶。农副产品的加工和综合利用需要用纤维素酶、果胶酶和木质素酶。此外，从木瓜中提取的木瓜蛋白酶，提高活性和固定化以后，可以被用来酿制啤酒和制造果汁。2、酶工程在用农产品开发生物活性肽方面的应用以前，人们认为氨基酸是人体吸收蛋白质的主要途径，随着研究发现，蛋白质经消化道中的酶水解后，主要以小肽的形式吸收，比完全游离的氨基酸更易吸收利用。这一发现，启发了科研工作者采用酶工程技术用蛋白质生产生物活性肽的新思路[8]。生物活性肽是蛋白质中20种天然氨基酸以不同排列组合方式构成的从二肽到复杂的线性或环形结构的不同肽类的总称，是源于蛋白质的多功能化合物。活性肽具有多种人体代谢和生理调节功能，易消化吸收，有促进免疫、激素调节、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂等作用，且食用安全性高。生物活性肽主要是通过酶法降解蛋白质而制得。目前已从大豆蛋白、玉米蛋白、牛奶蛋白、水产蛋白的酶解物中制得一系列功能各异的生物活性肽。3、酶工程在饲料工业中的应用动物体由于不能分泌分解纤维素、半纤维素、木质素、果胶等植物细胞壁物质的酶系，因此动物自身不能消化利用这些物质，只能通过瘤胃和大肠微生物利用上述部分物质。植物细胞壁非淀粉多糖降解酶可降解畜禽消化道内的非淀粉多糖，降低肠道内容物的粘性，促进营养物质的消化吸收，减少畜禽下痢，从而促进畜禽生长和提高饲料利用率。据赵长友[9]报道，利用纤维素复合酶作为半干贮添加剂可提高半干贮饲料的营养成分。蛋白质含量提高，粗纤维含量下降，半干贮品质得到改善，获得了色、味、嗅、质地及完好率均为上乘的优质半干贮饲料，并可抑制霉菌生长、防止腐败和延缓二次发酵，提高了半干贮饲料的完好率和利用率[10]。2.3酶工程技术研究应用前景酶工程的发展在生物工程学科的发展中占有重要位置。21世纪,生物科学与生物工程的发展将进一步揭示生命的奥秘，在世界科技和经济发展中起主导和支柱作用。作为生物工程重要组成部分的酶工程亦将飞速发展，前景广阔。21世纪酶工程的发展主题是[11]:新酶的研究与开发，酶的优化生产，酶的高效应用。除采用常用技术外，借助基因组学和蛋白质组学的最新知识，借助DNA重排和细胞、噬菌体表面展示技术进行新酶的研究与开发,目前最令人瞩目的新酶有核酸类酶、抗体酶和端粒酶等。充分发挥酶的催化功能、扩大酶的应用范围、提高酶的应用效率是酶工程应用研究的主要目标,要采用固定化、分子修饰和非水相催化等技术实现酶的高效应用，将固定化技术广泛用于生物芯片、生物传感器、生物反应器、临床诊断、药物设计、亲和层析以及蛋白质结构和功能的研究，使酶工程技术在各工业中发挥更大的作用。结论可以预计,随着各种高新技术的广泛应用及酶工程研究工作的不断深入,酶工程研究和酶制剂工业必将取得更快、更大的发展[12]。可以相信,将来人们可以用化学的方法随心所欲地构造出各种性能优异的人工合成酶和模拟酶,而且还可以采用生物学方法在生物体外构造出性能优良的产酶工程菌为生产和生活服务,酶工程技术必将在工业、医药、农业、化学分析、环境保护、能源开发和生命科