08分子发光分析

第8章分子发光分析法8.1概论8.1.1分子发光的类型按激发的模式分类：分子吸收光能被激发，所产生的发光为光致发光，如分子荧光和磷光。分子由化学反应的化学能或由生物体（经由体内的化学反应）释放出来的能量所激发，其发光分别称为化学发光或生物发光。以分子发光作为检测手段的分析方法称为分子发光分析法，本章所介绍的包括荧光分析法、磷光分析法和化学发光分析法。8.1.2分子发光分析法的特点灵敏度高。较吸收光度法一般要高2~3个数量级。选择性比较高。物质对光的吸收具有普遍性，但吸光后并非都有发光现象。即便都有发光现象，但在吸收波长和发射波长方面不尽相同，这样就有可能通过调节激发波长和发射波长来达到选择性测定的目的。样品量小，操作简便，工作曲线的动态线性范围宽。发光检测的高灵敏度，以及发光光谱、发光强度、发光寿命等各种发光特性对所研究体系的局部环境因素的敏感性，因此，发光分析法在光学分子传感器以及在生物医学、药学和环境科学等方面的应用更显示了它的优越性。8.2.1基本原理1.分子能级与跃迁分子能级比原子能级复杂；在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；第一、第二、…电子激发单重态S1、S2…；第一、第二、…电子激发三重态T1、T2…；8.2分子荧光与磷光光谱分析法2.电子激发态的多重度电子激发态的多重度：M=2S+1S为电子自旋量子数的代数和(0或1)；平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单重态能级低；大多数有机分子的基态处于单重态；S0→T1禁阻跃迁；通过其他途径进入(见能级图)；进入的几率小；3.激发态→基态的能量传递途径电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；传递途径辐射跃迁荧光延迟荧光磷光内转移外转移系间跨越振动弛预无辐射跃迁激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大；荧光：10-7～10-9s,第一激发单重态的最低振动能级→基态；磷光：10-4～10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态；S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l3外转换l2T2内转换振动弛豫非辐射能量传递过程振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12s。内转换：同多重度电子能级中,等能级间的无辐射能级交换。通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行。辐射能量传递过程荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（多为S1→S0跃迁），发射波长为l‘2的荧光；10-7～10-9s。由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；l‘2l2l1；磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态（T1→S0跃迁）；电子由S0进入T1的可能过程：（S0→T1禁阻跃迁）S0→激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→T1发光速度很慢：10-4～100s。光照停止后，可持续一段时间。荧光、磷光的寿命和量子产率荧光寿命：荧光分子处于S1激发态的平均寿命，可用下式表示：τf=1/（kf+ΣK）磷光寿命（τp）指的是磷光分子处于T1激发态的平均寿命，可由类似的公式表示。荧光量子产率：荧光物质吸光后所发射的荧光的光子数与所吸收的激发光的光子数之比值。由于激发态分子的衰变过程包含辐射跃迁和非辐射跃迁，故荧光量子产率可表示为ɸf=kf/(kf+ΣK)磷光的量子产率（ɸp）定义为：PPSTPjKKK8.2.1.2荧光、磷光与分子结构的关系1.分子产生荧光必须具备的条件（1）具有合适的结构；（2）具有一定的荧光量子产率。荧光量子产率（）：吸收的光量子数发射的光量子数荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射；•物质只有吸收了紫外可见光，产生*，n*跃迁，产生荧光•*与n*跃迁相比，摩尔吸收系数大102~103，寿命短•*跃迁常产生较强的荧光，n*跃迁产生的荧光弱，但可产生系间窜跃，产生更强的磷光2.化合物的结构与荧光1）共轭体系——有较强的荧光•具有共轭体系的芳环或杂环化合物，电子共轭程度越大，越易产生荧光;环越多，共轭程度越大，产生荧光波长越长，发射的荧光强度越强flex/nmlem/nm0.112052780.292863100.46365400苯萘蒽350菲线状环结构比非线状结构的荧光波长长•芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发生荧光•多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光法测定•3，4-苯并芘是强致癌物lex=386nmlem=430nm•具有强荧光的分子多数有刚性平面结构ocoo-oo-coo-oo-荧光素：氧桥把两个环固定在一个平面上，具有平面结构，强荧光物质酚酞：无氧桥把两个环固定，不能很好的共平面，为非荧光物质2）刚性平面结构-较稳定的平面结构反式：平面构型强荧光体顺式：非平面构型非荧光体C=CHHC=CHH例1,2-二苯乙烯•大多数无机盐类金属离子，不能产生荧光，但某些螯合物都能产生很强的荧光，可用于痕量金属离子的测定•不少有机配体是弱荧光体或不发荧光，但与Mn+形成螯合物后变为平面构型，就会使荧光加强或产生荧光•例：8-羟基喹啉为弱荧光体，与Mn+—Al3+、Mg2+形成螯合物后，能形成刚性结构，荧光加强NOHNOHM3）金属螯合物的荧光•取代基对荧光物质的荧光特征和强度也有很大影响。分成三类：（1）增强荧光的取代基——有-OH、-OR、-NH2、-NHR、-NR2等给电子基团•由于基团的n电子（孤对电子）的电子云与苯环上的轨道平行，共享了共轭电子，扩大了共轭体系，使荧光波长长移，荧光强度增强4）取代基的类型（2）减弱荧光的取代基——-COOH、-NO2、-COOR、-NO、-SH吸电子基团,使荧光波长短移，荧光强度减弱•芳环上被F、Cl、Br、I取代后，使系间窜跃加强，磷光增强，荧光减弱。其荧光强度随卤素原子量增加而减弱，磷光相应增强，这种效应为重原子效应。（3）影响不明显的取代基——-NH3+、-R、-SO3H等1.溶剂的影响同一荧光物质在不同的溶剂中可能表现出不同的荧光性质一般来说，溶剂的极性增强，荧光波长长移，荧光强度增大2.温度的影响——低温下测定，提高灵敏度因为辐射跃迁的速率基本不随温度变，而非辐射跃迁随温度升高显著增大。大多数荧光物质都随溶液温度升高荧光效率下降，荧光强度减弱。温度对磷光影响更大8.2.1.3影响分子发光的环境因素•大多数含有酸性或碱性基团的芳香族化合物的荧光性质受溶液pH的影响很大•共轭酸碱对是具有不同荧光性质的两种型体，具有各自的荧光效率和荧光波长OHO_OHH+_例：苯酚离子化后，荧光消失pH≈1有荧光pH≈13无荧光3.pH的影响•但两个苯环相连的化合物，又表现出相反的性质，分子形式无荧光，离子化后显荧光例：—苯酚有荧光无荧光OHO_另外，表面活性剂也会影响荧光强度和特性8.2.1.4荧光、磷光的猝灭1.猝灭发光分子与溶剂或溶质分子之间所发生的导致发光强度下降的物理或化学作用过程。与发光分子相互作用而引起发光强度下降的物质，称为猝灭剂。2.动态猝灭与静态猝灭猝灭剂与发光物质的激发态分子之间的相互作用引起动态猝灭；猝灭剂与发光物质的基态分子之间的相互作用引起静态猝灭。8.2.1.5激发光谱和发射光谱荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？1.荧光(磷光)的激发光谱曲线固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线（图中曲线I）。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大；2.荧光光谱(或磷光光谱)固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线(图中曲线II或III)。200260320380440500560620荧光激发光谱荧光发射光谱磷光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱3.激发光谱与发射光谱的关系a.Stokes位移激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。b.发射光谱的形状与激发波长无关电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图l2,l1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如l‘2)。c.镜像规则通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。镜像规则的解释基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然。200250300350400450500荧光激发光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱8.2.1.6荧光(磷光)强度与溶液浓度的关系溶液的荧光强度(If)与溶液吸收的光强度(Ia)及荧光量子产率(Фf）有如下关系If=fIa由Lambert-beer定律及吸收光强度的概念，可推导出，当bc≤0.05时，有：If=2.303fI0bc与荧光类似，溶液的磷光强度(IP)与低浓度下磷光物质浓度之间的关系可表示如下：IP=2.303STPI0bc随着溶液浓度的进一步增大，将会出现发光强度不仅不随溶液浓度线性增大、甚至出现随浓度的增大而下降的浓度效应。发光的再吸：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；（一）荧光分析仪器——主要由光源、单色器、液槽、检测器和显示器组成光源第一单色器液池检测器第二单色器检测器放大器及记录器lexlem与分光光度计有两点不同①两个单色器②检测器与激发光互成直角I0I8.2.2荧光、磷光分析仪器8.2.2.1荧光分析仪器•激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强度；适用波长范围宽•荧光计中，常使用卤钨灯作光源•荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯利用汞蒸气放电发光的光源；常用其发射365nm、405nm、436nm三条谱线以365nm的谱线最强应用最广泛的一种光源，可发射250~800nm很强的连续光源1、光源•荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量分析，不能获得光谱•大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器，有较高的分辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，又可获得荧光光谱•第一单色器作用：分离出所需要的激发光，选择最佳激发波长lex，用此激发光激发液池内的荧光物质lex•第二单色器作用：滤掉一些杂散光和杂质所发射的干扰光，用来选择测定用的荧光波长lem。在选定的lem下测定荧光强度，定量分析2、单色器•盛放测定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都透光，只能用手拿棱或最上边4、检测器•把光信号转化成电信号,放大,直接转成荧光强度•荧光的强度一般较弱，要求检测器有较高的灵敏度，荧光光度计采用光电倍增管•荧光分析比吸收光度法具有高得多的灵敏度，是因为荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度可大大提高荧光强度5、读出装置•记录仪记录或打印机打印出结果，扫描激发光谱和发射光谱3、样品池仪器光路图仪器框图该型仪器可进行荧光、磷光和发光分析；8.2.2.2磷光分析仪器荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有荧光发射的同时测量磷光。测量方法：（1）通常借助于荧光和磷光寿命的差别，采用磷光镜的装置将荧光隔开。（2）采用脉冲光源和可控检测及时间分辨技术。室温测量时，不需要杜瓦瓶。8.2.3荧光的常规测定方法1.直接测定法要求被分析物