08第8章蛋白质的鉴定

第二部分蛋白质的纯化与鉴定第五章原材料预处理技术第六章沉淀法第七章柱层析技术第八章蛋白质的鉴定第九章综合分析蛋白质化学第8章蛋白质的鉴定8.1、电泳技术8.2、蛋白质定量分析技术8.1、电泳技术8.1.1、电泳概述8.1.2、聚丙烯酰胺凝胶电泳8.1.3、变性聚丙烯酰胺电泳8.2.4、等电聚焦电泳电泳（electrophoresis，EP）带电粒子在直流电场的作用下，向着与其电性相反的电极方向移动，这种现象称之为电泳。电泳技术就是根据各种带电粒子在电场中迁移速度的不同而对物质进行分离的一类实验技术。8.1.1、电泳技术概述凝胶电泳的支持介质采用支持介质的目的:防止电泳过程中的对流和扩散，以使被分离的成分得到最大分辨率的分离。支持介质应具备的特性:化学惰性；不干扰大分子的电泳过程；化学稳定性好，均匀；重复性好；电内渗小等。固体支持介质分为两类：一类是如纸、醋酸纤维素薄膜、硅胶、矾土、纤维素等；另一类是淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶。聚丙烯酰胺凝胶（Polyacrylamidegel，PAG）聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（Acr）和交联试剂N，N'-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在有引发剂和增速剂的情况下聚合而成的。聚丙烯酰胺的特性，包括其机械性能、弹性、透明度、黏着度以及孔径大小均取决于两个重要参数T和C。T是两个单体的总百分浓度。T=（a+b）/m×100%C是与总浓度有关的交联百分浓度。C=b/(a+b)×100%a为丙烯酰胺的克数b为N,N’-甲叉双丙烯酰胺的克数m为水或缓冲液的终体积引发剂、增速剂和聚合丙烯酰胺的聚合通常是由化学或光化学过程完成的，常用过硫酸按（AP）、过硫酸钾、核黄素来引发此过程。用N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）、3-二甲胺丙睛等作为聚合过程中的增速剂。AP-TEMED体系：化学聚合作用，TEMED催化AP产生自由基，激活Acr单体，形成单体长链，在交联剂Bis作用下聚合。胶体的聚合反应：Ammoniumpersulfate(freeradicalinitiator)Acrylamide(monomer)Bis(acrylamide)(bridge)TEMED(catalyst)自由基的生成者成胶的基本单位架桥使聚合产生分枝帮助传递自由基的催化剂-(OS-SO)442-2SO4CH2=CH-CO-NH212112单体聚合反应：铸胶反应架桥物造成分枝端点自由基可再延续freeradicalBisBis聚合反应交错连结自由基形成核黄素-TEMED体系：光聚合作用，TEMED可以加速凝胶的聚合，但不加也可以聚合。光聚合作用通常需痕量氧原子存在。核黄素在TEMED及光照条件下，还原成无色核黄素，然后被氧化形成自由基，从而引发聚合作用。过量氧会阻止链长的增加。电泳仪及其附属设备凝胶电泳系统一般由电泳槽，电源和冷却装置组成，同时配套的有各种灌胶模具，染色用具等，同时还有电泳转移仪，凝胶干燥器和凝胶扫描仪。1、电泳槽电泳槽是凝胶电泳系统的核心部分。根据电泳的原理，凝胶都是放在两个缓冲腔之间电场通过凝胶连接两个缓冲腔。缓冲液和凝胶之间的接触可以是直接的液体接触，也可以间接通过滤纸桥、凝胶条或滤纸条。垂直电泳与圆盘电泳相比，由于胶板表面积大，易于冷却而提高分辨率。分离的区带平直。同一块凝胶上同时比较多个样品，保证结果的准确可靠。电泳后易于取出凝胶干燥保存或作电泳后的各种鉴定。水平电泳一般包括电泳槽基座、冷却板和电极，有的还包括安全盖。水平电泳槽的关键在于冷却板。冷却效果好，凝胶在冷却板上得到充分的冷却，可以在凝胶上加高压，大大缩短了电泳时间，提高了分辨率。水平电泳比垂直电泳的优越性1、分辨率高2、速度快3、准确度高4、灵敏度高5、凝胶厚度、尺寸和分离距离任选6、凝胶层薄7、加样数、加样位置任选，加样方便，易于自动化8、染色快、效果好9、等电聚焦时，可以在凝胶表面上直接测定pH梯度10、便于保存11、便于制成多功能方式12、便于使用半干技术2、灌胶模具垂直电泳所需的平板凝胶一般都是用两块平整的厚玻璃板来灌注。两块玻璃板之间用隔条隔开，再用夹子夹紧。为防止渗漏，隔条上涂一层真空硅酮油或用2%琼脂封住。3、电源作用：提供稳定的直流电源。分类：根据仪器电压范围可分3类常压电泳仪（600V），用于常规电泳。高压电泳仪(3000v)，用于等电聚焦和DNA测序。超高压电泳仪(30000-50000V)，用于毛细管电泳。选择电源主要根据电泳技术的需要，电泳方式与凝胶大小对电源要求也不同。1、考马斯亮蓝（coomassiebrillliantblue）考马斯亮蓝R250分子式C14H44O7H3S2Na分子量824λmax=560-590nm电泳的染色方法考马斯亮蓝G250（CBBG250）比R250多两个甲基。分子量854λmax=590-610nm特点:•灵敏度不如R250，但比氨基黑高3倍。•选择地使蛋白质染色而几乎无本底色。•适于作定量分析。2、银染色法（silverstains）机制：将蛋白带上的硝酸银(银离子)还原成金属银，以使银颗粒沉积在蛋白带上。银染中染色的程度与蛋白中的一些特殊基团有关。银染过程中蛋白质首先被固定，其作用之一是将蛋白固定在凝胶中或至少是阻滞扩散发生;之二是为了去除干扰染色过程的物质。常用的固定剂有戊二醛、乙醇、甲醇、醋酸以及三氯乙酸。银染法比考马斯亮蓝染色灵敏2个数量级。双胺银染方法8.1.2、聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）根据蛋白质分子在缓冲溶液中的大小、形状以及带电的多少，在恒定pH缓冲体系中的分离。常规聚丙烯酰胺凝胶电泳又称天然状态生物大分子凝胶电泳，属于非解离电泳。优点：可以在天然状态分离生物大分子;可分析蛋白质和别的生物分子的混合物:电泳分离后仍然保持生物活性。1、蛋白质的电泳行为从电泳观点看，蛋白质分子的最主要的特性是它的带电行为。每一种蛋白质分子在一定的pH环境中，它的氨基酸侧链基团或结合质子或解离而带正电或负电。2、分离原理以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质进行蛋白质的分离，在电泳过程中不仅取决于蛋白质的电荷密度，还取决于蛋白质的尺寸和形状。3、分类•连续电泳（continuousgel）：采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统，在恒定pH、离子强度下进行的区带电泳。•利用电荷效应进行分离，分子筛效应不明显。•适于浓度高、样品简单、加样量少的情况。•不连续电泳（diacontinuousgel）：使用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系的电泳方式。•分离中既有电荷效应和又有分子筛效应。•能够分离比较复杂些特殊的样品，分辨率高。不连续电泳装置示意图不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成：1）浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.9的Tris-HCl。2）分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9的Tris-HCl。3)电极缓冲液是pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液。浓缩胶（concentratinggel)：又称堆积胶（stackinggel）。组成是聚丙烯酰胺凝胶，浓度较稀，孔径相对较大。将较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔胶凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带，从而在分离胶中获得高分辨率分离。不参与分子筛分离，只对样品起浓缩作用。分离胶（separationgel）：又称电泳胶（runninggel）。通常孔径较小，通过选择合适的凝胶浓度，使样品得以分离。不连续电泳中的分离胶可分为均匀胶（homogeneousgel）和梯度胶（gradientgel）。•先导离子（lendingion）：也称前置离子，电泳中速度最快的离子，如Cl-。存在于样品和凝胶缓冲液中。•尾随离子（tailingion）：也称后置离子，是电泳时速度最慢的离子，如Gly-。与先导离子带同性电荷。存在于电极缓冲液中。•反向离子（counterion）：与前两种带异性电荷，存在于凝胶和电极缓冲液中。浓缩胶对蛋白质分子的聚集作用：分离胶浓缩胶样品8.96.9离子缺乏空间ABC++8.3•分子筛效应分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。•电荷效应样品经浓缩进入分离胶后，各种蛋白质所带净电荷不同，在电场下的迁移率也不同。•形状效应8.1.3、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium-dodecylsulphatepolyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE）•基本原理•SDS-PAGE类型•电泳条件的选择•实验方法•相对分子量的测定SDS-PAGE基本原理SDS-PAGE即十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据SDS和还原试剂将蛋白质分子解聚后亚基的大小，在恒定pH（碱性）缓冲系统中的分离。主要用于测定蛋白质亚基的分子量。1.蛋白质分子的结构2、蛋白质分子的解聚SDS作用：SDS在水中带负电荷，可以使蛋白质分子间氢键断裂，使分子去折叠，破坏其二级和三级结构。还原剂作用：β巯基乙醇和二硫苏糖醇（DTT），可以使蛋白质中半胱氨酸残基之间的二硫健打开解聚形成单链分子。在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，在100℃保温3-5分钟，分子被解聚为多肽链。解聚后的氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而消除了不同分子之间原有的电荷差异。三种不同性质蛋白质的电泳比较：MolecularWeightpINativePAGESDS-PAGEMobilityProteinQuaternaryStructureXYZTetramer(40,000)x4Monomer88,000Monomer60,0005.85.29.3FastSlowMediumSlowUpwardFastXYZ--+XYZ+SDSNative-PAGESDS-PAGE分子量及净电荷密度均影响迁移率只有分子量影响迁移率XYZ-+-3、影响SDS-蛋白复合物形成的因素SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，特别是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。(1)、溶液中SDS单体的浓度能与蛋白质结合的是SDS单体，单体浓度与SDS总浓度、温度和离子强度有关。为了保证蛋白质与SDS充分结合，蛋白质与SDS的重量比应为1:4或1:3。(2)、样品缓冲溶液的离子强度SDS在低离子强度的溶液中具有较高的平衡浓度，因此缓冲液离子强度常为10-100mmol/L。(3)、二硫键是否完全被还原β巯基乙醇的浓度通常为4-5%；二硫苏糖醇的浓度为2-3%。SDS-PAGE类型SDS连续电泳(1)加样；(2)加电场，分子开始迁移；(3)电泳结束SDS不连续电泳（分离胶为均匀胶）(1)加样；(2)加电场，分子浓缩在界面上；(3)电泳结束SDS不连续电泳（分离胶为梯度胶）(1)加样；(2)加电场，分子浓缩在界面上；(3)电泳结束电泳条件的选择1、缓冲液的选择连续电泳不连续电泳SDS-磷酸缓冲系统SDS-Tris-Gly缓冲系统SDS-Tris-醋酸钠缓冲系统SDS-Tris-硼酸缓冲系统SDS-咪唑缓冲系统SDS-尿素缓冲系统对分子量低于15kD的蛋白样品，为了提高分辨率最好使用SDS-尿素系统；如果用SDS电泳纯化蛋白的目的是为了测定氨基酸组成或氨基酸序列，则应该用硼酸盐代替甘氨酸，以减少由甘氨酸产生的背景。SDS电泳中需要使用样品缓冲液、凝胶缓冲液以及电极缓冲液。样品缓冲液常与凝胶缓冲液采用同一种系统，只是离子强度和SDS含量有区别。电极缓冲液可以采用相同或不同的系统。2、凝胶浓度的选择正确选择凝胶浓度非常重要;不同分子质量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度。凝胶浓度T（C=2.6%）分子量范围（kDa）凝胶浓度T（C=5%）分子量范围（kDa）525-200560-1701010-701020-10015501510-502040205-403、样品的处理还原SDS处理带烷基化还原SDS处理非还原SDS处理还原SDS