0一小型温泉中降解淀粉细菌的筛选_鉴定与淀粉酶性质初步分析_莫芹

28微生物学杂志2014年2月第34卷第1期JOUＲNALOFMICＲOBIOLOGYFeb．2014Vol．34No．1一小型温泉中降解淀粉细菌的筛选、鉴定与淀粉酶性质初步分析莫芹1，2，李腾云3，沈微1，2*，樊游1，2，陈献忠1，2，王正祥1，石贵阳1(1．江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122;2．江南大学中国高校工业微生物资源数据平台，江苏无锡214122;3．福喜(威海)农牧发展有限公司，山东乳山264500)摘要为筛选耐热淀粉酶产生菌并揭示其在温泉中的分布情况，从腾冲县腊幸村一小型热泉不同部位采集样品进行微生物分离及鉴定。样品在65℃培养，挑选形态有差异的菌落点种淀粉-台盼蓝平板，共获得34株具有淀粉降解能力的细菌。分子鉴定结果显示，从温泉底部沙土中筛选得到细菌具有较高的生物多样性，9株具有淀粉降解能力的细菌分别属于土芽胞杆菌(Geobacillus)、厌氧芽胞杆菌(Anoxybacillus)和芽胞杆菌(Bacillus)3个属、7个种，菌株间16SrDNA序列均有一定的差异。对编号为201(Geobacillusthermoglucosidasius)和208(Anoxybacillusflavithermus)的菌株胞外淀粉酶进行初步分析，其胞外淀粉酶最适温度分别为60和70℃，均高于淀粉糊化温度，具有一定的应用潜力。关键词腾冲;温泉;淀粉酶;嗜热细菌中图分类号Q93文献标识码A文章编号1005－7021(2014)01－0028－05doi:10．3969/j．issn．1005－7021．2014．01．006Screening＆IdentificationofStarchDegradableBacteriafromSmallHotSpring＆InitialEnzymaticPropertyAnalysisofItsAmylaseMOQin1，2，LITeng-yun3，SHENWei1，2，FANYou1，2，CHENXian-zhong1，2，WANGZheng-xiang1，SHIGui-yang1(1．KeyLab．ofIndust．Biotech．，MinistryofEduc．，2．DataPlatformofIndust．MicrobialＲes．ofChinaUni．＆Coll．，JiangnanUni．，Wuxi214122;3．OSIGroup(Weihai)AgropastoralDevel＇tCo．Ltd，Ｒushan264500，ShandongProv．)AbstractInordertoscreenthermostableamylaseproducingbacteriaandinvestigatethemicrobialdistributioninhotspring，sampleswerecollectedfromdifferentpartofasmallhotspringinLaxingvillage，Tengchongcountytocarryoutmicrobeisolationandcharacterization．Thesampleswerecultivatedat65℃forselectionofthermophilicbacteriumwithcoloniesofdifferentmorphologyandthenweretransferredtostarch-trypanblueplates，andobtained34starchdegradablebacterialstrainswerescreened．Theresultsofmolecularidentificationrevealedthatbacteriascreenedfromthebottomsandandsoilofhotspringpossessedfairlyhighbiologicaldiversity，9starchdegradablestrainswererespectivelybelongedtothegenusofGeobacillus，Anoxybacillus，Bacillusand7species．Thereweredifferencesintheinterspecific16SrDNAsequences．Initialanalysesofextracellularamylaseofthestrainsnumberedas201and208whichwereidentifiedasGeobacillusthermoglucosidasiusandAnoxybacillusflavithermus，andtheresultsshowedthattheoptimumtemperatureoftheirextracellularamylasewererespectivelyat70℃and60℃，theywerehigherthanthestarchdextrinizationtemperature，possessingacertainapplicationpotential．KeywordsTengchongHotspring;amylase;thermophilicbacterium基金项目:国家863高技术研究发展计划(2013AA102101-5);江苏省科技支撑计划(SBE201270477)作者简介:莫芹女，硕士研究生。研究方向为微生物学。E-mail:[e-mail]*通讯作者。男，工学博士，副教授。研究方向为微生物学。E-mail:[e-mail]收稿日期:2013-06-07;修回日期:2013-06-261期莫芹等:一小型温泉中降解淀粉细菌的筛选、鉴定与淀粉酶性质初步分析29淀粉酶是催化淀粉分子中α-1，4糖苷键或α1，6糖苷键水解的一类水解酶。在常温条件下，淀粉均以不溶于水的结晶颗粒形式存在，淀粉酶不能与淀粉分子接触，因此不能起到水解淀粉的作用。当淀粉悬液加热到较高温度时，淀粉颗粒吸水膨胀，发生糊化现象，这时淀粉水解酶才可以充分接触淀粉分子从而使淀粉水解。淀粉的糊化温度一般在60℃以上，因此工业上使用的淀粉水解酶一般需要具有较高的耐热性。温泉是筛选耐热细菌的宝库，同时也是获得耐热型淀粉水解酶及其基因资源的宝库。我国科学家对腾冲温泉中耐热细菌资源的多样性及组成进行了详细的研究，并从中筛选出大量有应用价值的耐热型细菌［1-6］。云南省腾冲县是我国温泉资源最丰富的地区之一，拥有大小数百个温泉。本文以腾冲县腊幸村温泉群中一个未经开发的小型温泉为例，对其中具有淀粉降解能力的细菌进行分离鉴定，为进一步开发新型耐热淀粉酶提供一定的参考。1材料与方法1．1材料1．1．1样品来源云南省腾冲县腊幸村一小型温泉。1．1．2培养基高温菌培养基:酵母膏1g，蛋白胨1g，硫酸镁0．1g，硝酸钾0．1g，硝酸钠0．69g，磷酸钠0．1g，硫酸亚铁0．002g，微量元素溶液1mL，琼脂粉15g，定容至1L并调整pH至7;微量元素溶液:在2L烧杯中加入900mL纯净水，煮沸后冷却至50℃以下，加入EDTA0．1g充分溶解，依次加入硫酸锰0．05g，硫酸铜0．02g，六水硝酸钴0．01g，十水硼酸钠0．02g，钼酸铵0．01g，硫酸锌0．096g;淀粉-台盼蓝培养基:可溶性淀粉10g/L，蛋白胨2g/L，酵母膏2g/L，NaCl5g/L，Trypanblue0．1g/L，pH7．2～7．4。1．2方法1．2．1产淀粉酶高温菌的筛选称取样品悬浮于水中，适当稀释后涂布于高温菌培养基上，65℃培养24h。选择单菌落点种淀粉培养基平板，55℃培养48h，观察透明圈。根据菌落形态，挑取淀粉平板上不同形态透明圈的菌落，在淀粉培养基平板上划线分离，55℃培养48h，进一步观察菌落周围是否有透明圈。有透明圈的细菌初定为产淀粉酶细菌，斜面保存。1．2．2产淀粉酶细菌的分子鉴定细菌染色体DNA的提取按文献［7］介绍的方法进行。斜面上挑取1环菌体于50μL无菌水中，混匀后加入100μL裂解液，混匀，85℃保温15min即得到染色体DNA粗提液，离心后取1μL直接用于后续PCＲ。细菌16SrDNA基因扩增方法如下:取200μLPCＲ管1支，分别加入36．5μL去离子水，10×Buffer5μL，dNTP5μL，引物P16sUP和P16sDW，各1μL，Taq酶0．5μL，上述染色体DNA粗提液1μL。PCＲ程序:95℃5min;95℃0．5min，50℃1min，72℃，1．5min，30个循环;72℃10min。PCＲ反应引物序列:P16sUP:5'-AGAGTTTGATC-CTGGCTCAG-3';P16sDW:5'ACGGCTACCTTGT-TACGACTT-3'。PCＲ产物送上海生工生物工程公司测序。利用美国国家生物技术信息中心的BLAST软件将测序结果与GenBank收录的序列进行同源性搜索比对。1．2．3淀粉酶发酵摇瓶培养条件培养基组成:玉米淀粉2%，豆饼粉2%，(NH4)2SO40．2%，CaCl20．01%。接种细菌斜面培养物1环于上述液体培养基中，55℃摇瓶培养48h，检测淀粉酶酶活。淀粉酶酶活的测定参照“中华人民共和国行业标准QB1805．1-93:2-淀粉酶活力的试验方法”［8］进行。酶活定义:1h液化1g可溶性淀粉所需酶量为1个酶活力单位，以U/mL表示。1．2．4酶学性质的测定分别配制pH5～9(间隔0．5)的磷酸氢二钾-柠檬酸缓冲液，测定酶在不同pH缓冲液中的酶活力，以最高酶活为100%计算相对酶活确定酶的最适作用pH。在pH8．5的磷酸氢二钾-柠檬酸缓冲液中，将酶液适当稀释，分别在50～80℃(间隔10℃)条件下检测酶活。以最高酶活力为100%计算相对酶活确定酶的最适反应温度。2结果与分析2．1样品初筛结果所有样品用生理盐水适当稀释后直接涂布LB以及pH为7和9的高温菌培养基，65℃培养24h。根据样品稀释情况推算每克样品形成的菌落数，结果见表1。表1不同培养基样品微生物菌落数量统计Table1Colonycountsofhotspringsamplesondifferentcultureplates培养基菌落数/gLBpH7高温菌培养基pH9高温菌培养基水样0190沙土3765136腐殖质04×10467由表1可见，LB培养基虽然是细菌通用培养基，但是对于高温菌的培养效果不佳。在所研究的样品中，只有温泉底部沙土中有3株菌可以在24h内形成菌落。本文所采集的水、沙土及腐殖质均为碱性，但在中性高温菌培养基上形成的菌落数远高于在pH9的培养基上形成的菌落数，这说明自然界中嗜中性的细菌比较多。2．2降解淀粉细菌的筛选与鉴定选择上述平板上形态有差异的菌落，点种到淀粉-台盼蓝平板上，55℃培养48h，观察透明圈。结果显示，在所选择的共计约300个菌落中，大约有10%的菌落可以在淀粉-台盼蓝平板上形成透明圈。不同样品获得的菌落产生透明圈的情况见表2。表2样品产淀粉酶菌落数量统计Table2Colonycountsofamylaseproducingbacteriainhotspringsamples微生物学杂志34卷30菌落来源点种数量形成透明圈菌落数水样200沙土(LB)60沙土(pH7)1049沙土(pH9)110腐殖质(pH7)6622腐殖质(pH9)103由表2可见，从水样中获得的菌落数量少，且均不具有降解淀粉的能力。从菌落形态看，来源于水样的细菌形成的菌落形态差异小，很可能来源于同一个或亲缘关系接近的物种。在温泉水底泥沙中获得的菌落大约有8%具有降解淀粉的能力。腐殖质中获得的菌落大约有1/3具有降解淀粉的能力。腐殖质中降解淀粉微生物含量高可能是这一环境中含有较多的淀粉等高分子有机物，具有这一类高分子分解能力的微生物具有生长优势。2．3降解淀粉细菌的分子生物学鉴定将上述34株具有淀粉降解能力的细菌划线分离，