10-ELISA结果影响因素.

ELISA测定结果影响因素2020/1/15主要内容一、ELISA简介二、ELISA试验结果影响因素ELISA简介ELISA(EnzymeLinkedImmunosorbnentAssay)是酶联接免疫吸附测定的简称。是一种免疫学测定方法，主要通过抗原抗体反应检测液体标本中目的蛋白性质、功能及含量。ELISA实验原理抗原或抗体在体外结合到某种固相载体表面后，仍然能保持其免疫学活性并能相互特异性结合。抗原抗体复合物与酶标二抗结合，加入合适的底物，在酶的作用下显色，颜色深浅与特异性抗体成比例关系，可进行定性和定量分析。抗原抗体反应的特异性+酶高效催化反应的专一性ELISA检测方法抗原测定方法抗体测定方法双抗体夹心法竞争法双抗原夹心法竞争法间接法主要操作流程+已知抗体包被于载体表面加待检物无抗原与抗体结合-EEEEEEEEE已知抗体包被于载体表面加待检物抗原与抗体结合加酶标抗体与抗原结合加酶作用的底物产生颜色加酶标抗体与抗原结合加酶作用的底物不产生颜色双抗体夹心法测抗原ELISA结果判定1.定性测定(1)肉眼观察：比较检测孔与对照孔的颜色。(2)阳性判定值法(cut-offvalue，CO值)：一般为阴性对照的平均A值加一个常数，标本A值≥CO值即为阳性。(3)抑制率法：在竞争抑制法中结果可用抑制率表示。抑制率(％)＝(阴性对照A-待测A)／阴性对照AX100％,一般以抑制率≥50％为阳性2.半定量测定结果一般以滴度表示。将标本连续稀释后，进行ELISA检测，在阳性临界值以上的最高稀释度即为该标本的“滴度”。3.定量测定用己知量的标准品作一系列稀释后进行ELISA测定，与待测标本同时进行测定，绘制标准曲线，结果以绝对量或活性单位表示。ELISA结果判定结果判定方法的选择：间接法和夹心法ELSIA（阳性孔呈色深于阴性孔)竞争法ELISA（阳性孔呈色浅于阴性孔）1.定性结果可以用肉眼判定2.阳性判定值3.标本/阴性对照比值1.阳性判定值法2.抑制率法3.不可用肉眼判断结果影响因素ELISA方法被广泛应用于各种抗原和抗体测定。但测定中影响因素较多，而且其操作中有一定的技术要求，在检测过程中除正常反应外，有时会出现一些错误结果。引起错误结果的原因主要有：1、标本因素2、试剂因素3、操作因素4、环境因素。结果影响因素——标本因素内源性物质类风湿因子补体嗜异性抗体自身抗体医源性诱导的抗体交叉反应物外源性物质标本溶血标本污染贮存过久凝集不全采血管中添加物标本引起的假阳性和假阴性结果主要是干扰性物质所致，分为内源性物质和外源性物质两种。结果影响因素——标本因素内源性物质：（1）类风湿因子与ELISA系统中的捕捉抗体及酶标记二抗的FC段直接结合，导致假阳性结果。解决办法是：①用F(ab)2替代完整的IgG；②标本用联有热变性（63℃，10min）IgG的固相吸附剂处理（将热变性IgG加入到标本稀释液中同样有效）；③检测抗原时，可以用2-巯基乙醇等加入到标本稀释液中，使RF降解。（2）补体ELISA系统中固相一抗和标记二抗过程中，抗体分子发生变构，其FC段的补体C1q分子结合位点被暴露出来，使C1q可以将二者连接起来，从而造成假阳性。解决的办法是：①用EDTA稀释标本；②用53℃，10min或56℃，30min加热血清使C1q灭活。（3）嗜异性抗体人类血清中含有能与啮齿类动物（如鼠等）Ig(s)结合的天然嗜异性抗体，可将ELISA系统中一抗和二抗连接起来，也能造成假阳性。解决办法是：可在标本稀释液中加入过量的动物Ig(s)，但加入量不足或亚类不同时无效。结果影响因素——标本因素（4）嗜靶抗原的自身抗体抗甲状腺球蛋白、抗胰岛素等嗜靶抗原的自身抗体，有时能与靶抗原结合形成复合物，在ELISA方法中均可干扰抗原抗体测定结果。解决的办法：测定前用理化方法将其解离。（5）医源性诱导的抗鼠Ig(s)抗体鼠源性CD3等单克隆抗体治疗，用放射性同位素标记鼠源性抗体的影像诊断及靶向治疗等新技术，均有可能使病人体内产生抗鼠抗体；另外，被鼠等啮齿类动物咬伤的病人体内也可以产生抗鼠Ig(s)抗体。这些病人ELISA测定时均可产生假阳性。解决的办法是：测定抗原时，在标本中加入足量的正常鼠Ig(s)。（6）交叉反应物质类地高辛、类AFP样物质等，是与靶抗原有交叉反应的物质。在用多抗测定抗原时对测定结果影响不大，但在用单克隆抗体测定抗原时，假如交叉抗原决定簇正好是所用单克隆抗体相对应的靶决定簇时，也会出现假阳性结果。结果影响因素——标本因素外源性物质：（1）标本溶血红细胞溶解释放的血红蛋白具有过氧化物酶活性，在以辣根过氧化物酶为标记的ELISA测定中，会导致非特异性显色，故标本采集时应避免溶血。（2）标本受细菌污染菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶，同溶血标本一样，可产生非特异性显色而干扰测定结果。（3）标本保存不当标本放置时间过长（一天以上），会使抗原或抗体免疫活性减弱，亦可出现假阴性。冰箱中久存的标本，血清中IgG可聚合成多聚体、AFP可形成二聚体，在间接法ELISA测定中会导致本底过深、甚至假阳性；为克服上述干扰，ELISA测定的血清标本宜为新鲜采集；如不能立即测定，5天内测定的血清标本可存放于4℃，1周后测定的血清标本应低温冻存；冻存后融解的标本，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混合后再测定，但混匀时应轻柔，不可强烈振荡。结果影响因素——标本因素（4）标本凝集不全在没有促凝剂和抗凝剂的情况下，正常血液采集后1.5~2h开始凝固，18~24h完全凝固。临床检验工作中，有时为了争取时间快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，此时的血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果；这类情况于次日复查时因血凝已完全，血清中不再有纤维蛋白原存在，故复查结果变为阴性。为避免上述干扰作用，血液标本采集后最好使其充分凝固再分离血清，或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。（5）标本管中添加物质的影响抗凝剂（如肝素，EDTA）、酶抑制剂（如NaN3可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶活性）及分离胶等均对ELISA测定有一定干扰作用。结果影响因素——标本因素[1].许斌等.ELISA检测HBsAg影响因素的探讨.临床检验杂志.2000.VoI.18.No.4表1内外源物质的干扰结果影响因素——试剂因素试剂的选择试剂的选择是保证血液检测质量的关键要素。不同厂家的试剂在使用效果上存在差异。要选购知名度相对高、信誉可靠的试剂。重视试剂质量同时有效地进行室内质控以及参加室间质量评价。特别是室间质评可以发现实验本身不易发现的不准确性，了解各实验室之间结果的差异，帮助校正使结果具有可比性。试剂盒中阴性对照的质量尤为重要，当阴性对照吸光度（OD值）较高，夹心法易产生假阴性，而竞争抑制法易产生假阳性。结果影响因素——试剂因素试剂的准备1.观察外包装，有无漏液，注意效期等。2.仔细阅读说明书，严格按照试剂说明书进行操作。3.操作前将试剂在室温下平衡30-60分钟，保证酶等液体的初始反应温度及活性剂的溶解。液体温度吸头温度的移取的液体体积会偏大液体温度吸头温度的移取的液体体积会偏小结果影响因素——操作因素显色比色加样温育时间和温度洗板显色比色结果影响因素——操作因素加样①加样不可太快，避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。加样时如有气泡，抗原抗体不能有效地结合会导致弱阳性甚至假阴性。②每次加标本应更换吸头，以免发生交叉污染。③加酶结合物、加底物，应使加液量准确均一，加液过程迅速完成。滴加时，除了要注意滴加的角度垂直外，滴加的速度也很重要。滴加太快，很容易出现重复滴加或加在两孔之间的现象。④有些测定需用稀释的血清，应保证稀释液与血清混合均匀。结果影响因素——操作因素曲线的高峰部分是抗原抗体分子比例合适的范围，称为抗原抗体反应的等价带(zoneofequivalence)。在此范围内，抗原抗体充分结合，形成的沉淀物最多，表明抗原与抗体浓度的比例最为合适，称为最适比(optimalratio)。钩状效应：即HOOK效应,是指由于抗原抗体比例不合适而导致假阴性的现象，其中抗体过量叫做前带效应；抗原过量叫做后带效应。结果影响因素——操作因素正常情况下的双抗体夹心法ELISA反应一步法抗原过量时出现钩状效应特点：不易发现对结果的影响：强阳性→假阴性解决方法：标本稀释结果影响因素——操作因素[2]王珂等.ELISA法测梅毒螺旋体抗体钩状效应2例分析.中国误诊学杂志.2008Vol8No.33.表2不同血清稀释度下的S/OD值（OD值为0.105）项目原倍1:21:41:81:161:321:641:1281:256标本10.923.778.1112.2515.2417.8816.3410.887.58标本20.632.594.835.8210.037.495.783.952.60温育（成败关键）每种试剂都有其最佳反应模式，其中温度和温育时间是重要因素。结果影响因素——操作因素[3].刘运保.操作因素对ELISA检测结果的影响.公共卫生与预防医学.2005.Vol.16.No.4表3不同孵育条件对结果的影响[4]许萍等.不同温育环境ELISA检测抗—HCV的比较.临床检验杂志.2002.Vol.20.Mo.3A.1、2、3全部在雅培鼓风式恒温系统温育B.1、2、3全部在水浴恒温箱温育C.1、2干式3水浴D.1、2水浴3干式E.1水浴2、3干式F.1干式2、3水浴G.1水浴2干式3水浴H.1干式2水浴3干式1.反应板中加待检样品37℃60min2.加酶标记物37℃60min3.加底物溶液37℃30min表4不同温育条件下的检测结果结果影响因素——操作因素边缘效应使用96孔板的ELISA测定中，常发生“边缘效应”，即外周孔显色较中心孔深。经研究证实在温育中的热力学梯度可能是根本原因。聚苯乙烯本身为不良热导体，在实验室的常规ELISA测定中，将板从室温置于37℃温箱(非水浴)，板孔升温时，在外周孔与中心孔之间可能存在一热力学梯度。因此反应板不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。所以温育一般采用能使反应液温度迅速达到平衡的水浴法。另外，酶标板也是一个比较重要的因素，选择质量好一点的板能一定程度减少板内误差。结果影响因素——操作因素5[1].许斌等.ELISA检测HBsAg影响因素的探讨.临床检验杂志.2000.VoI.18.No.4结果影响因素——操作因素洗板在ELISA中正确的洗涤是保证得到可重复结果的关健一步，应引起操作者重视。ELISA就是靠洗涤来达到分离游离和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以消除残留在板孔中没能与固体抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。结果影响因素——操作因素显色有研究报道按A、B液的顺序分别滴加和将A、B液混合后滴加，检测结果有显著差异,中值阳性和高值阳性分别平均下降了33.6%和30.0%[2]。OPD（邻苯二胺）底物显色一般在室温或37℃反应20-30分钟后即不再加深，再延长反应时间，可使本底值增高。OPD底物液受光照会自行变色，显色反应应避光进行。TMB（四甲基联苯胺）受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观察结果。TMB经HRP作用后，约40分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2小时后即可完全消退至无色。[2].刘运保.操作因素对ELISA检测结果的影响.公共卫生与预防医学.2005.Vol.16.No.4结果影响因素——操作因素比色作为记录测定结果的仪器，酶标仪的性能稳定与否，决定结果的可靠度。①定期进行保养，对滤光片要定期校正。②设置要正确，最好使用双波长。③读数时最好先擦试微孔板底部并压平板条。④酶标仪不要安置在阳光或强光照射下，⑤使用前先预热仪器15-30分钟，测读结果更稳定。结果影响因素——操作因素[4]谭凌卉.ELISA法检测HBV血清标志物影响因素的分析.湖南师范大学学报（医学版）2009.6（2）.图1终止反应后酶标仪