11-硕士研究生课-现代分子生物学-核酸研究进展-2-李恩民

1增强或抑制生物系统中目标基因表达核酸实验研究技术进展－22增强生物系统中目标基因表达核酸实验研究技术进展－2增强生物系统中目标基因表达实验技术路线确定目的基因获得目的基因cDNA构建表达载体细胞转染表达效果检测1.化学合成法2.RT－PCR法3.cDNA文库克隆关键环节一：合理关键环节二：筛选核酸实验研究技术进展－24来源于PCR产物、cDNA克隆、限制性酶切片段的目的基因可以与供体载体通过BP反应形成入门克隆（entryclone）。目的基因可以在入门克隆与多种载体间通过LR反应进行转换，形成表达克隆。核酸实验研究技术进展－25抑制生物系统中目标基因表达核酸实验研究技术进展－26反义封闭目标基因表达技术反义封闭目标基因表达的两个关键环节：目标基因转录后剪接加工环节目标基因mRNA翻译起始环节核酸实验研究技术进展－27100.0﹣80.0﹣60.0﹣40.0﹣20.0﹣相对光密度102.9100.038.299.71234100.0106.5108.6113.7100.0﹣80.0﹣60.0﹣40.0﹣20.0﹣相对光密度1234M12341234M200bp600bpNGALGAPDHNGAL基因转录RT-PCR的检测结果M,DNAmarker,100bpladder;1,SHEECwithoutplasmid;2,pcDNA3;3,pcDNA-NGAL(+);4,pcDNA-NGAL(-).核酸实验研究技术进展－28MMP-9MMP-2M1234kD2121701167653600﹣500﹣400﹣300﹣200﹣100﹣542.625.01234300﹣250﹣200﹣150﹣100﹣50﹣251.43.80.0100.0MMP-9相对密度单位1234100.00.0MMP-2相对密度单位M.蛋白marker，1.培养液空白对照，2.食管癌细胞对照3.有义促进NGAL基因表达的食管癌细，4.反义封闭NGAL基因表达的食管癌细胞细胞培养上清液中MMP-9和MMP-2的活性结果表明通过有义、反义技术使NGAL基因表达发生改变可以对食管癌细胞分泌的MMP-9和MMP-2的活性产生明显影响。核酸实验研究技术进展－29食管癌细胞裸鼠移殖瘤HE染色（400）(A)对照组：食管癌细胞SHEEC(B)实验组1：有义促进NGAL基因表达的食管癌细胞SHEEC(C)实验组2：反义封闭NGAL基因表达的食管癌细胞SHEEC结果表明，反义封闭NGAL基因表达会明显抑制食管癌裸鼠成瘤细胞的浸润行为。（A）（B）（C）核酸实验研究技术进展－210永生化食管上皮细胞由永生化食管上皮细胞恶变的食管癌细胞反义封闭NGAL基因表达的食管癌细胞激光共聚焦检测NGAL基因表达反义封闭后食管癌细胞的形态结果表明，反义封闭NGAL基因表达后，食管癌细胞F-actin的分布变得均匀，F-actin小体减少，细胞间连接重新建立，结构较紧密，细胞的整体形态与永生化食管上皮细胞相近。核酸实验研究技术进展－2RNA干扰（RNAinterference，RNAi）RNAi的定义发现RNAi现象的科学意义RNAi研究发展简史RNAi技术路线的选择RNAi技术应用举例核酸实验研究技术进展－2RNA干扰的定义某些短片段双链RNA能够以序列互补基因mRNA为靶标，促使其降解，高效特异地阻断基因表达，诱使细胞表现相应基因缺失表型。这种现象叫做RNA干扰（RNAinterference）。核酸实验研究技术进展－2发现RNAi现象的科学意义深刻揭示了细胞内基因沉默的机制。为后基因组时代研究基因的功能提供了有力工具。核酸实验研究技术进展－2RNAi研究发展简史95,GuoandKemphues,Cell:senseandantisensehasthesameeffectsinC.elegans98FireandMello,Nature:RNAi98,KennerdellandCarthew,Cell:injectdsRNAintoflyembryotoinduceRNAi99,TuschlSharp,G&D:dsRNAinducesRNAiincellextracts99,HamiltonBaulcombe,Science:smallRNAasguideinplant00,HammondHannon,Nature:isolateRISC00,ZamoreBartel,Cell:21-23bpintermediate01,ElbashirTuschle,Nature:siRNA04,YukihideTomari,Science:siRNAasymmetryincorporateintoRISC05,……06,…………核酸实验研究技术进展－2FirstfoundinC.elegans:dsRNArepressesgeneexpressionmuchmoreeffectivelythanantisenseAndrewFireet.al.Nature1998,CarnegieInstitutionofWashingtonNoStainingAntisenseRNAMex-3RNAibyinsituhybridizationinembryosdsRNA核酸实验研究技术进展－2RNAi实验技术路线确定目的基因设计siRNA序列获得siRNA产物siRNA转染RNAi效果检测1.化学合成siRNA2.体外转录siRNA3.siRNA表达载体4.siRNA表达框架关键环节二：纯度关键环节三：效率关键环节一：合理核酸实验研究技术进展－2RNAi应用举例通过RNAi干扰fascin基因表达核酸实验研究技术进展－2Passage7Passage8Passage9PSCNT←Fascin←β-actin←Fascin←β-actinPSCPSF1NTPSF20.960.080.551.00←Fascin/β-actinratio核酸实验研究技术进展－2NTPSF核酸实验研究技术进展－2核酸实验研究技术进展－2核酸实验研究技术进展－2核酸实验研究技术进展－2核酸实验研究技术进展－2