11级食科-食品酶学-实验指导书

食品酶学实验指导书食品科学与工程学院2013年实验一唾液淀粉酶的催化性质实验（4学时）一、实验目的加深对酶的催化性质的认识，观察酶的专一性以及温度、酸度（pH）等因素对酶活性的重要影响。二、实验原理酶具有高度的专一性。淀粉和蔗糖无还原性，唾液淀粉酶水解淀粉生成有还原性的麦芽糖，但不能催化蔗糖的水解。蔗糖酶能催化蔗糖水解产生还原性葡萄糖和果糖，但不能催化淀粉的水解。可用班氏试剂检查糖的还原性。酶的活性受温度的影响，在最适温度下，酶的催化反应速度最高，大多数动物酶的最适温度在37-40℃，植物酶的最适温度为50-60℃。偏离此最适环境时，酶的活性减弱。酶的活力受环境pH的影响极为显著。不同酶的最适pH不同。本实验观察pH对唾液淀粉酶活性的影响，唾液淀粉酶的最适pH为6.8。淀粉和各类糊精遇碘呈现不同的颜色，最简单的糊精和麦芽糖遇碘不呈色。在不同温度下，唾液淀粉酶对淀粉水解活力的高低可以通过水解混合物遇碘呈现颜色的不同来判断。三、试剂和器材1、试剂①2%蔗糖溶液。②新配制的溶于0.3%氯化钠的1%淀粉溶液。配制方法：称取可溶性淀粉1g，先用少量0.3%氯化钠溶液调成糊状，再用0.3%氯化钠溶液稀释至100mL，煮沸至溶液变为澄清透明。③稀释200倍数的新鲜唾液。④新配制的溶于0.3%氯化钠的0.5%淀粉溶液。配制方法：称取可溶性淀粉0.5g，先用少量0.3%氯化钠溶液调成糊状，再用0.3%氯化钠溶液稀释至100mL，煮沸至溶液变为澄清透明。⑤班氏试剂无水硫酸铜1.74g溶于100mL热水中，冷却后稀释至150mL，取柠檬酸钠173g、无水碳酸钠100g和600mL水共热。溶解后冷却并加水至850mL。再将冷却的150mL硫酸铜溶液注入。本试剂为天兰色，澄清透明，可长期保存。⑥碘化钾-碘溶液：将碘化钾2g及碘1g溶于20mL水中，混匀后定容至100mL。⑦0.1mol/L柠檬酸溶液。⑧0.2mol/L磷酸氢二钠溶液。2、器材恒温水浴、试管、试管架、吸管、滴管、白瓷板等。四、操作步骤1、酶的专一性表1淀粉酶专一性实验表管号1234561%淀粉溶液/滴4－4－4－2%蔗糖溶液/滴－4－4－4稀释唾液/mL－－11－－煮沸过的稀释唾液/mL－－－－11蒸馏水/mL11－－－－37℃恒温水浴15min班氏试剂/mL111111沸水浴2~3min现象注：①“煮沸过的稀释唾液”直接用电炉加热至沸，要确保煮沸2min以上，使得酶完全钝化。②每组提前在37℃水浴中放入一个烧杯（盛有一定量的水），使烧杯中水温达到37℃。③班式试剂与还原糖作用，会产生橘黄色混浊。2、温度对酶活力的影响淀粉和可溶性淀粉遇碘呈蓝色。糊精按其分子的大小，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色或红色，最小的糊精和麦芽糖遇碘不呈色。在不同的温度下，淀粉被唾液淀粉酶水解的程度，可由其遇碘呈现的颜色来判断。取3支试管，编号后按表2加入试剂。表2温度对酶的活力影响实验表管号1231%淀粉溶液/mL1.51.51.5稀释唾液/mL11－煮沸过的稀释唾液/mL－－1摇匀后，将1号、3号两试管放入37℃水浴中，2号试管放入冰水中。（2号试管加入稀释唾液后，必须立即放入冰水中）10min后取出，（将2号管内液体分为两半），用碘化钾-碘溶液来检测1、2、3管内淀粉唾液淀粉酶水解的程度。记录并解释结果。将2号管剩下的一半溶液放入37℃水浴中继续保温10min后，再用碘液试验，判断记录。3、pH值对酶活力的影响取4个标有号码的50mL锥形瓶或烧杯。用吸管按表3添加0.2mol/L磷酸氢二钠溶液和0.1mol/L柠檬酸溶液以制备pH5.0~8.0的4种缓冲液。表3pH值对酶的活力影响实验表锥形瓶号0.2mol/L磷酸氢二钠溶液0.1mol/L柠檬酸溶液pH值15.15mL4.85mL5.026.05mL3.95mL5.837.72mL2.28mL6.849.72mL0.28mL8.0注：可以多组同学共同配制上述4个缓冲液，使用移液管，要准确移取。从4个锥形瓶中各取缓冲液3mL，分别注入4支编好号的试管中，随后于每个试管中添加0.5%淀粉溶液2mL和稀释200倍的唾液2mL。向各试管中加入稀释唾液的时间间隔各为1min。将各试管内容物混匀，并依次置于37℃恒温水浴中保温。在第4管中加入唾液2min后，每隔1min由第3管取出1滴混合液，置于白瓷板上，加1滴碘化钾-碘溶液，检验淀粉的水解程度。待混合液变为碘化钾-碘溶液的颜色时，向所有试管依次添加1滴碘化钾-碘溶液时间间隔，从第一管起，亦均为1min。观察各试管内容物呈现的颜色，分析pH对唾液淀粉酶活性的影响。五、实验要求1、表2实验中，若2号试管加入稀释唾液后，没有及时放入冰水中，会出现什么实验现象呢？为什么？2、“三、试剂和器材⑴试剂”中有如下描述“②新配制的溶于0.3%氯化钠的1%淀粉溶液”，为什么1%淀粉溶液中要加入0.3%的氯化钠呢？3、有的同学在表2实验中，加入碘化钾-碘溶液后，3根试管皆出现蓝色，是什么原因造成的？请帮解决该问题。实验二卷心菜中过氧化物酶活的测定（2学时）一、实验原理果蔬中的往往存在过氧化物酶，过氧化物酶催化的典型反应为：H2O2+AH2→A+2H2OAH2是无色的还原性化合物，如果它经过氧化转变成有色的A，那么反应体系在特定波长下的吸光值就会随反应进行而增加。因此，可以用分光光度法测定过氧化物酶的活力。二、试剂和仪器1、试剂0.05mol/L磷酸盐缓冲液pH7.0、含1.0mol/LNaCl（Buffer1）、0.1mol/L磷酸盐缓冲液pH7.0（Buffer2）、1%邻苯二胺-乙醇溶液、0.3%过氧化氢溶液2、仪器组织捣碎机、抽滤装置、水浴锅、721分光光度计（含比色皿）、秒表、常规玻璃仪器三、实验步骤1、从卷心菜中提取过氧化物酶125g卷心菜中加入125mL缓冲液Ⅰ，均质（20,000rpm，2min）后抽滤，滤过液为粗酶液。2、过氧化物酶活力测定将从卷心菜中萃取得到的过氧化物酶粗酶液置于试管中，取适量酶液稀释10-15倍左右，过滤后测定酶活。向比色皿中加入2.6mL缓冲液Ⅱ，0.1mL邻苯二胺-乙醇溶液，0.2mL过氧化氢溶液，然后加入0.1mL酶液，并立即搅匀计时，在430nm下测OD值随时间的变化。在2min内每隔10s读一次数，然后以OD值为纵坐标，反应时间为横坐标作出OD值-时间曲线，从曲线最初的直线部分斜率计算POD的活力，以每分钟OD值增加1个单位定义一个酶活单位（U）。四、数据记录与处理实验三卷心菜中过氧化物酶热稳定性的研究（2学时）一、实验原理果蔬中的过氧化物酶往往具有较高的热稳定性，对果蔬进行热烫处理时，常以过氧化物酶是否失活作为热烫是否充分的标准。果蔬热烫之后，如果其过氧化物酶完全（或95%以上）被破坏，那么就可以认为存在于果蔬中的其它酶都已失活。许多研究表明果蔬中的过氧化物酶有热稳定和热不稳定两部分。这两部分的比例取决于果蔬的品种和热烫处理的温度。二、试剂和仪器1、试剂0.05mol/L磷酸盐缓冲液pH7.0、含1.0mol/LNaCl（Buffer1）、0.1mol/L磷酸盐缓冲液pH7.0（Buffer2）、1%邻苯二胺-乙醇溶液、0.3%过氧化氢溶液2、仪器组织捣碎机、抽滤装置、水浴锅、721分光光度计（含比色皿）、秒表、常规玻璃仪器三、实验步骤1、从卷心菜中提取过氧化物酶采用实验二的方法提取过氧化物酶。2、过氧化物酶热处理将从卷心菜中萃取得到的过氧化物酶粗酶液置于试管中。稀释10倍后分别置于已编号的试管中，将试管在60℃水浴中保温1min，然后移至85℃水浴锅中，分别处理0.5min、1min、1.5min、2min、3min、5min、7min和10min，然后立即将试管转移至冰浴中，快速冷却至0℃后测定残余过氧化物酶活力。3、过氧化物酶活力测定如果热处理后酶液中产生混浊，应在比色前过滤去除沉淀。采用实验二的方法测定残余过氧化物酶活力。四、数据记录与处理