11色谱分析法概论.

色谱法是一种重要的分离、分析技术混合试样→分离→单组分→检测→定性、定量分析色谱法的由来色谱法的创始人－俄国植物学家茨维特(M.Tswett)色谱法的由来在茨维特的实中：装有CaCO3的玻璃管——色谱柱CaCO3——固定相纯石油醚——流动相色谱法的由来在该实验中，碳酸钙上混合色素被分成不同色带的现象，像一束光线通过棱镜时被分成不同色带的光谱现象一样，因此茨维特把这种现象称为色谱，相应的分离方法称为色谱法（色层法，层析法）高分离效能、高灵敏度、高选择性、分析速度快、应用范围广色谱法的特点:色谱学的重要作用•诺贝尔化学奖：1948年，瑞典提塞留斯(Tiselius)，电泳和吸附分析；1952年，英国马丁(Martin)和辛格(Synge)，分配色谱。•应用的科学领域：生命科学、材料科学、环境科学等。（科学的科学）•药学（药物分析）：各国药典收载了许多色谱分析方法。中国药典二部，700多，纯度检查、定性鉴别或含量测定，一部，600多鉴别或含量测定。•中药复方制剂质量测检和中药配伍中的应用色谱法实质是分离色谱分离的基本条件：1.互不相溶的两相（流动相、固定相）；2.被分离组分在两相之间作相对运动色谱法实质—分离•分离依据：各组分在两相之间作用力不同(吸附能力分配系数离子交换能力大小排阻能力其他亲合作用)•各组分差速异行→分离色谱法分类按两相状态分色谱法分类按分离过程机制分吸附色谱法—利用吸附剂表面对不同组分物理吸附性能的差异分配色谱法—组分在两相中分配系数不同离子交换色谱法—利用离子交换原理排阻色谱法—利用多孔性物质对不同大小分子的排阻作用等等色谱法分类•按固定相的固定形式分色谱法柱色谱纸色谱薄层色谱（平板色谱）色谱法分类附：根据所使用的技术不同分高效液相色谱(HPLC)化学键合相色谱衍生气相(液相)色谱裂解色谱顶空气相色谱色谱制备色谱分析第二节色谱过程一、色谱过程实现色谱操作的基本条件是必须具备相对运动的两相，固定相(stationaryphase)和流动相(mobilephase)。色谱过程是组分的分子在流动相和固定相间多次“分配”的过程。色谱过程•组分的结构和性质微小差异与固定相作用差异随流动相移动的速度不等差速迁移色谱分离。1.气相色谱分离过程当试样由载气携带进入色谱柱与固定相接触时，被固定相溶解或吸附;随着载气的不断通入，被溶解或吸附的组分又从固定相中挥发或脱附;挥发或脱附下的组分随着载气向前移动时又再次被固定相溶解或吸附;随着载气的流动，溶解、挥发，或吸附、脱附的过程反复地进行。当试样由载气携带进入色谱柱与固定相接触时，被固定相溶解或吸附;随着载气的不断通入，被溶解或吸附的组分又从固定相中挥发或脱附;色谱图被分析试样从进样开始，经色谱柱分离，到各组分全部流过检测器在此期间所记录下来的响应信号随时间而变化的曲线（分布的图像），称为色谱流出曲线或色谱图。色谱图及常用术语色谱峰在一定色谱条件下，组分通过检测器时，响应信号随时间而变化的曲线称为色谱峰。色谱过程按近理想条件和分配系数恒定时的流出曲线为对称的高斯分布曲线，对应的高斯分布函数为：222exp2)(RitttAh色谱图及常用术语•基线在色谱操作条件下仅有流动相通过检测器时，反映检测器噪声随时间变化的曲线。稳定的基线是一条直线。•峰高从色谱峰顶点到基线的距离'ABh区域宽度1.峰底宽度在色谱峰两边的转折点(也叫拐点即EF)所画的切线与基线相交的截距。两个拐点E和F之间的距离为EF=，分别位于处。h607.0wb2区域宽度2.半峰宽峰高一半处的宽度GHw21354.221w3.标准偏差σ两个拐点E和F之间的距离的一半4.峰面积A色谱峰与基线延长线所包围的面积，精确计算时whA21065.1•保留值的定义1.保留时间从进样开始到色谱峰最大值出现时所需的时间tR•保留值的定义2.死时间不被固定相保留的组分，从进样开始到色谱峰最大值出现时所需的时间。(空气、甲烷或乙醚峰的保留时间）。实际上为流动相流经色谱柱所需要的时间：tMuLtM——柱长（cm)——流动相平均线速度(cm/s)保留值的定义3.调整保留时间组分的保留时间与死时间之差tttMRR'tR'色谱保留值表明色谱峰在色谱图中的位置（可用时间t、体积V、距离d表示）。它是由色谱分离过程中的热力学因素所决定的。色谱常用术语保留值的定义4.保留体积从进样开始到色谱峰最大值出现时所需通过的流动相的体积5.死体积6.调整保留体积VRVMVVtFVMRRcR''tFVRcRFc在LC中为实测值（mL/min)在GC中为校正到柱稳住压下的平均流速•相对保留值某一组分与基准物质的调整保留值之比：KKVVttrsisisiis''''ttttMMisRRsi•总分离效能指标•分离度(resolution；R)：又称分辨率。是相邻两色谱峰保留时间之差与两色谱峰峰宽均值之比。21RR21RR)(22/)(1212WWttWWttR＝＝•设正常峰，W1≈W2=4σ，•则R=1.5时，99.7%面积(tR±3σ)被分开，∆tR=6σ，称6σ分离。R＜1,峰重叠，未分开R=1,认为基本分开，4σ分离R=1.5,两峰完全分离，6σ分离三、分配系数与色谱分离(一)分配系数和容量因子•分配系数(distributioncoefficient；K)是在一定温度和压力下，达到分配平衡时，组分在固定相(s)与流动相(m)中的浓度(C)之比。ms=CCK分配系数仅与组分、固定相和流动相的性质及温度（和压力）有关。是组分的特征常数。•容量因子(capacityfactor；k)：在一定温度和压力下，达到分配平衡时，组分在固定相和流动相中的质量(m)之比。（摩尔数？）•又称为质量分配系数或分配比。分配系数与色谱分离msmmk还与固定相和流动相的体积有关。mmssVCVCmsVVK容量因子与分配系数的关系tR=t0(1+k)tR=t0(1+K)分配系数与色谱分离（二）分配系数和容量因子与保留时间的关系uvR'v=L/tRu=L/t0RttR0'ssmmmmSmmsmm'VCVCVCNNNtttRkR11'RttR0'msVV0'R00Rtttttk（三）色谱分离的前提•KA≠KB或kA≠kB是色谱分离的前提。=t0(1+KA)ARtmsVVBRt=t0(1+KB)msVVtR=t0(KA－KB)msVVtR≠0KA≠KBkA≠kB分配系数与色谱分离推导过程：色谱理论需要解决的问题：色谱分离过程的热力学和动力学问题。影响分离及柱效的因素与提高柱效的途径，柱效与分离度的评价指标及其关系。组分保留时间为何不同？色谱峰为何变宽？组分保留时间：色谱过程的热力学因素控制；（组分和固定液的结构和性质）色谱峰变宽：色谱过程的动力学因素控制；（两相中的运动阻力，扩散）两种色谱理论：塔板理论和速率理论；塔板理论的假设：(1)在每一个平衡过程间隔内，平衡可以迅速达到；(2)将载气看作成脉动（间歇）过程；(3)试样沿色谱柱方向的扩散可忽略；(4)每次分配的分配系数相同。10-2-1塔板理论-柱分离效能指标1.塔板理论（platetheory）半经验理论；将色谱分离过程比拟作蒸馏过程，将连续的色谱分离过程分割成多次的平衡过程的重复（类似于蒸馏塔塔板上的平衡过程）；色谱柱长：L，虚拟的塔板间距离：H，色谱柱的理论塔板数：n，则三者的关系为：n=L/H理论塔板数与色谱参数之间的关系为：222116545)()(./bRRWtYtn保留时间包含死时间，在死时间内不参与分配!2.有效塔板数和有效塔板高度•单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。•用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。•组分在tM时间内不参与柱内分配。需引入有效塔板数和有效塔板高度：222/1)(16)(54.5bRRWtYtn理有效有效有效nLHWtYtnbRR2'22/1')(16)(54.53.塔板理论的特点和不足(1)当色谱柱长度一定时，塔板数n越大(塔板高度H越小)，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。(2)不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。(3)柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数K相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。(4)塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果，也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。10-2-2速率理论-影响柱效的因素1.速率方程H=A+B/u+C·uH：理论塔板高度，u：载气的线速度(cm/s)减小A、B、C三项可提高柱效；存在着最佳流速；A、B、C三项各与哪些因素有关？A─涡流扩散项A=2λdpdp：固定相的平均颗粒直径λ：固定相的填充不均匀因子固定相颗粒越小dp↓，填充的越均匀，A↓，H↓，柱效n↑。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。B/u—分子扩散项B=2νDgν：弯曲因子，填充柱色谱，ν1。Dg：试样组分分子在气相中的扩散系数（cm2·s-1）(1)存在着浓度差，产生纵向扩散;(2)扩散导致色谱峰变宽，H↑(n↓)，分离变差;(3)分子扩散项与流速有关，流速↓，滞留时间↑，扩散↑;(4)扩散系数：Dg∝(M载气)-1/2；M载气↑，B值↓。k为容量因子；Dg、DL为扩散系数。减小担体粒度，选择小分子量的气体作载气，可降低传质阻力。C·u—传质阻力项传质阻力包括气相传质阻力Cg和液相传质阻力CL即：C=（Cg+CL）ggDdkkC2p22)1(01.0LfLDdkkC22)1(322.载气流速与柱效——最佳流速载气流速高时：传质阻力项是影响柱效的主要因素，流速，柱效。载气流速低时：分子扩散项成为影响柱效的主要因素，流速,柱效。H-u曲线与最佳流速：由于流速对这两项完全相反的作用，流速对柱效的总影响使得存在着一个最佳流速值，即速率方程式中塔板高度对流速的一阶导数有一极小值。以塔板高度H对应载气流速u作图，曲线最低点的流速即为最佳流速。3.速率理论的要点(1)组分分子在柱内运行的多路径与涡流扩散、浓度梯度所造成的分子扩散及传质阻力使气液两相间的分配平衡不能瞬间达到等因素是造成色谱峰扩展柱效下降的主要原因。(2)通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速可提高柱效。(3)速率理论为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。(4)各种因素相互制约，如载气流速增大，分子扩散项的影响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使柱效下降；柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的影响，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。10-2-3分离度塔板理论和速率理论都难以描述难分离物质对的实际分离程度。即柱效为多大时，相邻两组份能够被完全分离。难分离物质对的分离度大小受色谱过程中两种因素的综合影响：保留值之差──色谱过程的热力学因素；区域宽度──色谱过程的动力学因素。色谱分离中的四种情况如图所示：色谱分离中的四种情况：①柱效较高，△K(分配系数)较大,完全分离；②△K不是很大，柱效较高，峰较窄，基本上完全分离；③柱效较低，，△K较大,但分离的不好；④△K小，柱效低，分离效果更差。分离度的表达式：R=0.8：两峰的分离程度可达89%；R=1：分离程度98%；R=1.5：达99.7%（相邻两峰完全分离的标准）。)(.)()()(/)(/)()()()()()(121221121212699122YYttWWttRRRbbRR令Wb(2)=Wb(1)=Wb（相邻两峰的峰底宽近似相等），引入相对保留值和塔板数，可导出下式：161112212121121221211212有效nrrWtttrWtttWttWWttRbbbbbRRRRRRRRRR)()()()('''''''')()()()()()()()()()()()(