11载体系统

第十章载体系统载体系统一、质粒载体二、噬菌体载体三、cosmid克隆载体四、噬菌粒载体五、酵母人工染色体载体六、细菌人工染色体载体一、质粒载体（一）质粒的一般生物学特性（二）基因工程中质粒载体的构建（三）pBR322质粒载体（四）pUC质粒载体（五）质粒载体的稳定性问题（一）质粒的一般生物学特性1质粒的概念质粒（plasmid）是独立于染色体外、具有自主复制能力的遗传单位，其本质是较小的核酸分子，大小范围在1kb-200kb以上不等。2细菌质粒的一般生物学特性：1）很多细菌中已发现；2）是独立于细菌染色体之外的辅助性遗传单位，基因组绝大部分为双链环状DNA，不同质粒大小各异；3）大多数质粒的宿主范围较窄；4）已发展进化出多种机制以维持其在细菌宿主中的稳定的拷贝数；在不同的宿主细胞中拷贝数可能不同。5）复制转录的进行依赖于宿主编码的酶和蛋白质；6）常含有一些编码对细菌宿主有利的酶的基因。单链切割连接单链切割连接共价闭合环形DNA（SC型）开环DNA（oc型）线性DNA（L型）环形双链的质粒DNA分子具有三种不同构型3质粒的命名用小写字母p代表质粒（plasmid），在p字母后用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名称，再加上质粒编号。如：pBR322：p表示一种质粒，而“BR”则是分别取自该质粒的两位主要构建者F.Bolivar和R.L.Rodriguez，322为编号。4质粒给宿主细胞的标记(1)氨苄青霉素(Ampicillin)(2)卡那霉素(Kanamycin)(3)四环素（Tetracycline）(4)氯霉素(Chloramphenicol)(5)链霉素（Streptomycin）(6）潮霉素（Hygromycin）5质粒的复制类型根据质粒DNA复制与宿主之间的关系分为：（1）“严紧型”复制控制的质粒(stringentplamid)：拷贝数少；（2）“松弛型”复制控制的质粒(relaxedplasmid)：拷贝数多。6质粒DNA的转移(1)质粒的类型据能否自我转移可分为:接合型（conjugativeplasmid)非接合型（non-conjugativeplasmid)(2)F质粒(fertilityfactor)F+又叫雄性决定因子，所以F+细胞又叫雄性细胞，相应的F–又叫雌性细胞。F质粒(94kb)在寄主细胞中有三种不同存在方式：①F+②F`③Hfr。7质粒的转化转化（transformation）：是将异源DNA分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新遗传性状的一种手段。质粒转化细菌常用方法：热激法、电击法（二）基因工程中的质粒载体克隆载体(cloningvector):使目的片段能在细菌细胞中复制的载体;表达载体（ExpressionVector）:使目的基因能在细菌细胞表达为RNA或蛋白质的载体。1.克隆载体必备条件（1）具有复制起点（2）具有抗菌素抗性基因（3）具有若干限制酶单一识别位点（4）具有较小的相对分子质量和较高的拷贝数。2.表达载体的必备条件(1)能自主复制(2)具有方便、灵活的克隆位点和筛择标记(3)具有能为大肠杆菌RNA聚合酶所识别的强大启动子(4)启动子应可受诱导调控(5)具有强终止子(6)具有翻译起始信号3天然质粒用作载体的局限性天然质粒相对分子质量拷贝数单一酶切位点选择性标记复制类型pSC1015.8×1061~3EcoRItetr严紧ColE14.2×10620EcoRI大肠杆菌素松弛RSF21247.4×10610EcoRI(BamHI)ampr松弛局限性：分子量高、拷贝数低、合适的单一酶切位点少、选择标记不合适4质粒载体的选择标记选择标记的应用：利用质粒编码的可选择标记选择目标菌落。常用的选择标记：抗氨苄青霉素、抗四环素、抗氯霉素和抗卡那霉素等基因。（三）pBR322质粒载体pBR322质粒载体的形体图pBR322质粒载体的结构来源TetrAmprOripBR322质粒载体的优点：♣具有较小的相对分子质量(4363bp)♣具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号(Ampr和Tetr)♣具有较高的拷贝数（松弛型）DNA连接酶pBR322质粒载体tetr基因插入失活效应（四）pUC质粒载体pUC18pUC19含四个部分：（1）来自pBR322的质粒复制起点（ori）；（2）ampr;（3）大肠杆菌β半乳糖苷酶基因（lacZ）的启动子及其编码α-肽链的DNA序列；（4）多克隆位点（MCS）lacZ`OriAmprMCSBlueWhiteampramprInsertInsertNoinsertLacZ`LacZ`♣具更小的分子质量(2.69kb)和更高的拷贝数♣适于组织化学方法检测重组体♣具多克隆位点MCS区段pUC质粒载体的优点(五）其它重要的质粒载体1.穿梭质粒载体（shuttleplasmidvector）是一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，因而可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体（六）质粒载体的稳定性问题1不稳定性类型♣分离不稳定性♣结构不稳定性2影响稳定性主要因素♣新陈代谢负荷♣拷贝数差度二、噬菌体载体1噬菌体的结构及其核酸类型2噬菌体的生命周期3λ噬菌体载体4M13噬菌体载体1噬菌体的结构及其核酸类型不同种类的噬菌体颗粒，在结构上有很大差别。三种不同基本类型：♣无尾部的二十面体型♣具尾部的二十面体型（大多数噬菌的构形）♣线状体型T2噬菌体结构示意图♣双链线性DNA（最常见）♣双链环形DNA♣单链环形DNA♣单链线性DNA♣单链RNA噬菌体的核酸：2噬菌体的生命周期（1）溶菌生长周期噬菌体（烈性噬菌体）（2）溶源生长周期噬菌体（温和噬菌体）（1）烈性噬菌体的生活周期t=0噬菌体吸附到寄主菌的细胞壁，大约在吸附的2秒钟内就会发生噬菌体DNA的注入；t=1寄主DNA、RNA和蛋白质的合成反应被全部关闭；t=2第一个噬菌体mRNA开始合成；t=3细菌DNA开始降解；t=5噬菌体DNA合成开始启动；t=9“晚期”噬菌体mRNA开始合成；t=12出现完整的头部和尾部结构；t=15出现头一个完整的噬菌体颗粒；t=22细菌发生溶菌作用，释放出约300个左右的噬菌体时粒E.coliT4噬菌体的生命周期（以分钟记）（2）温和噬菌体裂解循环溶源态（2）温和噬菌体的生活周期3λ噬菌体载体（1）λ噬菌体的分子生物学概述（2）λ噬菌体载体（1）λ噬菌体的分子生物学概述λ噬菌体（温和型）颗粒中的DNA是一线性双链DNA分子，长48502bp，两端各有12个碱基的5`凸出黏性末端是互补的。进入细胞的λDNA通过两端的黏性末端环化。λ噬菌体上有些基因可被取代而不影响其生活周期。λ噬菌体DNA的核酸内切限制酶的限制图（Kb）（2）λ噬菌体载体主要有如下特点：1)筛选简便；2)可克隆的片段大，最大可达23kb，而质粒最大仅10kb左右；3)转化效率高。λ噬菌体载体可分为：插入型载体替换型载体注意：λ噬菌载体作为载体，其重组噬菌体DNA大小只能：38kb~52kb。体外包装：λ噬菌载体+尾部蛋白+头部蛋白λ噬菌体载体是主要用于cDNA文库构建，也经常用于外源目的基因的克隆。4M13噬菌体载体6.4kb单链环状正链DNA基因组。作载体的优点：(1)RFDNA和SSDNA都可感染E.coli，产生噬菌斑；(2)无包装限制问题（可6倍于M13基因组）；(3)复制以双链环形DNA为中间媒介；(4）易测出外源DNA的插入方向；(5）可产生能直接测序的单链DNA分子。三、cosmid克隆载体cosmid（cossite-carringplasmid）人工构建的含有λDNA的cos位点序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。pHC79柯斯质粒载体pHC79的形体图由pBR322质粒DNA与λ噬菌体DNA的cos位点及其控制包装作用的序列构成部分柯斯质粒的基本特性1.cosmid质粒载体的特点：1）具有λ噬菌体的特性（但因不含全部必需基因，因此不能通过溶菌周期，无法形成子代噬菌体颗粒）；2）具有质粒的特性（有质粒复制子及抗菌素基因）；3）具有高容量的克隆能力（本身仅5-7kb,克隆极限可达45kb左右）；4）具有与同源序列质粒进行重组的能力。广泛应用于基因组DNA文库的构建。2.柯斯克隆（cosmidcloning）理论依据是：1）在线性噬菌体DNA分子的每一端，都具有一段彼此互补的单链突出序列（cos位点)。2）在λ噬菌体的正常生命周期中，会产生出由数百个λDNA拷贝组成的多连体分子。在此种分子中，前后两个λDNA基因组之间都是通过cos位点连接起来的。3）λ噬菌体具有的一种位点特异的切割体系(site-specificcuttingsystem),又叫Ter体系，能识别两个相距适宜的cos位点(38-45kb)，将多连体分子切割成λ单位长度的片段，并将它们包装到λ噬菌体头部中去。(如EcoRI)38kb~52kb四噬菌粒载体（phagemidvector)由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型载体系列，称为噬菌粒（phagemid或phasmid）噬菌体质粒单链噬菌体辅助噬菌体大肠杆菌寄主菌株pEMBL8pUC8f1IR171/18pRSA101πVXM13M13变异株XS127，XS101pUC118/pUC119pUC18/pUC19M13M13K07MV1184pBSpUCf1M13K07XL-Blue1.几种常用的噬菌粒载体的一般特征pUC119(MCS)pUC118(MCS)puC118和pUC119噬菌粒载体的分子结构pBluescriptSK(+/-)2958bppBluescriptSK(+/-)噬菌粒载体的分子结构图2.噬菌粒载体的优点（1）具小分子量的共价、闭合、环状的基因基因组DNA，可克隆高达10kb的外源DNA；（2）有ampr等基因作为选择记号；（3）拷贝数高；（4）存在多克隆位点,可克隆达10kb的外源DNA；（5）可用组织化学显色反应筛选重组子；（6）具质粒复制起点，在无辅助噬菌体存在下，克隆外源基因可按质粒一样复制；（7）有单链噬菌体复制起点，在有噬菌体辅助感染的宿主细胞中，可合成出单链DNA拷贝，并包装成噬菌体颗粒分泌到培养基中。(8)可直接对克隆的基因进行核苷酸测序。(yeastartificialchromosome,YAC)真核生物染色体的几个最为重要的部位：着丝粒、端粒和复制起始点YAC本身可小至8kb（如pYAC2质粒），克隆能力可达1000kb以上。五酵母人工染色体载体(bacterialartificialchromosome,BAC)BAC载体是建立在大肠杆菌的F因子（大小约100kb）的基因础上；人工构建的BAC较小（如pBeloBAC11仅有7.4kb，保留了与F因子的自主复制、拷贝数控制及质粒分配等功能相关基因），但其克隆能力可达300kb以上，远大于柯斯质粒，但小于YAC。六细菌人工染色体载体•（七）质粒转化大肠杆菌•1．重组质粒的鉴定•当质粒的重组或其它载体重组后，通常会发生质粒的重组失败，包括质粒的自身环化。因而要求进行筛选，把重组成功的质粒找出来。•在目前常用的质粒和其它载体中含有相应的抗生素抗性基因，一旦重组成功，或者不含插入片段的质粒自身环化，抗生素抗性基因表达，被转化的大肠杆菌便具备抵抗相应抗生素的能力，可以在含该抗生素的培养基上生长传代。假如重组失败，大肠杆菌便不能抵抗该抗生素而死亡。•2．为扩增质粒和其它载体作准备•由于大肠杆菌繁殖快，在适宜的条件下繁殖一代仅需要20-30分钟，而且常用质粒可以在大肠杆菌中增殖达到几百个拷贝。因此，通过对转化成功的大肠杆菌培养，可以在短时内极大地扩增目的质粒。•*作为分子生物学用大肠杆菌，是经过实验室改造过的工程菌。•原理•通过CaCl2对特定的大肠杆菌处理，制备感受态的细菌。这些细菌可使每微克超螺旋质粒DNA，如一些插入目的DNA片段的重组质粒，产生5×106-2×107个转化的菌落。•当质粒与这些大肠杆菌混合后，质粒粘附在大肠杆菌的表