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异种移植研究进展南京医科大学第一附属医院泌尿外科夏国伟临床器官移植发展史：1954年Murray首次施行同卵双生姐妹间的肾移植获得成功；1959年Murray和Hamburger各自为异卵双生同胞间施行肾移植，受者接受全身照射使移植肾获得长期存活；1961年Hitchings等将硫唑嘌呤用作嘌呤代谢的抑制剂，抑制抗体的产生，并延长兔皮肤同种移植物的存活。1962年Murray施行首例尸体肾移植，受者服用硫唑嘌呤获得长期存活。自此，现代器官移植时期正式开始。由于以上贡献，Hitching和Murray分别荣获1989年、1990年诺贝尔奖金。随着外科技术（血管吻合技术），组织器官低温保存技术的进步及免疫抑制药物（特别是环孢素）控制排斥反应的成功，临床同种异体移植飞速发展。移植种类逐步扩大到心、肝、脾、肺、小肠、骨髓、骨、关节及胰岛细胞等几乎所有重要脏器和组织。移植对象也扩展到儿童和老人，器官及组织移植已成为拯救脏器终末性病变的唯一有效手段。器官短缺已成为全球性的难题，越来越多的患者在等待器官中死去；人们积极探索异种移植的可能性。一，异种移植的历史与现状1905年Princeteau将兔肾切成片，移植于病人的肾包膜下，以治疗尿毒症，结果并无功能，但开创了异种移植在临床应用的先例。此后人们又进行过猪、羊、猴的全肾移植给人的尝试，由于完全没有应用免疫抑制疗法，均未成功。1964年在移植医学史上可称为异种移植年。Reemtsma、Hitchcock、Starzl先后施行猩猩、猴、狒狒对人的异种肾移植，共18例，达到4日至9个月的成活；Hardy施行第一例猩猩对人的异种心脏移植，但因心输出不足而失败。此后，随着同种移植进入现代免疫抑制治疗时期，移植成绩显然优于异种移植，异种移植进入低潮时期。但60年代的异种移植研究取得了两个进展：首先Kisseyer-Nielson等报道，1例同种移植因发生“超急性排斥”而失败，研究者认为与受者血液中存在着抗供体抗体有关；第二是Perper与Najarian发现异种移植两种根本不同的后果。种系关系较近的移植如羊和山羊、黑猩猩和人，移植物在发生排斥反应前可行使一段时间的功能，类似于同种排斥反应。而种系关系较远的异种移植如狗和猪、猪和人，其结果则完全不一样，这种异种移植因发生超急排斥反应而失败。1970年，Calne根据对异种移植的观察，首次提出异种移植的协调性和不协调性概念。异种移植种系组配中，不产生超急性排斥的属于“协调性”（Concordant）反应，这种移植供受体间进化关系较近，存活以日为计，类似于第一次同种移植排斥，如猩猩给人，狗与狼、大鼠与小鼠之间均属此类；产生超急性排斥的属于“不协调性”（discordant）反应，该种移植供受体间进化关系较远，排斥以分成小时计算，类似于第二次接触抗原的同种排斥反应。超急性排斥反应成为异种移植在临床应用中难以逾越的障碍，此分类法具有科学性和临床适用性双重价值。Hasan等将Concordant又进一步分为困难型和容易型：如仓鼠对大鼠的移植，应用抑制抗体产生的药物如环磷酰胺可延长移植物存活，但即使加上环孢素A也不能诱导出耐受，因而为Concordant困难型；而抗CD4T淋巴细胞单抗可以诱导大鼠对小鼠心脏移植耐受，因而为Concordant容易型。据此，狒狒对人为困难型；猩猩对人为容易型；而猪对人则为discordant。人们在70～80年代相继进行了猩猩对人肝移植，狒狒、猩猩对人的心脏移植，但结果均未获长期存活。随着环孢素而来的同种移植巨浪几乎完全将异种移植淹没。由于同种移植的飞速发展，供体缺乏的矛盾日益突出，停顿多年后，异种移植又于1992年重新开始。活动性乙肝被认为是同种肝移植的禁忌征，Starzl认为狒狒肝对乙肝病毒不易感，从而为该类患者进行了狒狒肝异种移植治疗，术后使用FK506、泼尼松、环磷酰胺及前列腺素，但第一例患者术后70天死于由真菌感染引起的脑出血，尸检未发现狒狒肝有肝炎样损害。第二例患者术后26日死于腹膜炎和败血症。第三例患者为自身免疫性肝炎，肝昏迷脑水肿。行猪异种肝移植作为暂时过渡，手术非常成功，肝有功能并产生胆汁，脑压及凝血机制恢复正常，但术后第三日因脑压回升，在同种供肝移植前死去。由于异种移植困难重重，移植界重新回到了对异种移植价值和基本理论再度深入探讨的平静时期，也就是说除基础研究外再也没有任何鲁莽的异种移植临床报告。但人类可以从这些尝试中得出以下结论并对异种移植怀有信心：①异种器官曾在人体内发挥过功能并能维持一段时间生命；②异种排斥可以用抗同种排斥的方法逆转，说明异种排斥过程至少在某些方面与同种排斥相同；③有些异种移植患者可以长期存活（9个月），说明异种移植有可能获得成功。二，异种移植抗原和异种移植免疫的认识猪等哺乳动物细胞表面存在大量作为糖蛋白或糖脂质部分构成成分a-半乳糖链（a-galactosyl,a-Gal）抗原，它被公认为存在于除旧世纪灵长目以外的哺乳动物体内的异种抗原，是针对人等灵长类的主要异种抗原决定簇。除a-gal抗原外，尚有非a-gal抗原的存在与分布：Oriol研究发现，与人类ABO血型抗原相对应的A＋/A－猪的抗原分布；Tn和Fossman抗原，经吸附去除抗a-gal抗体的人血清与HTg转染小鼠脾细胞强烈反应，可推测人血清中存在抗Tn和抗Fossman天然抗体。经TNF诱导的血管内皮细胞表达gp65和gp100，gp65亦可由IL－1诱导表达。这两种抗原均非a-gal抗原，但都能被天然抗体识别。此外猪的主要组织相容性抗原SLA-I和SLA-II也可能是非a-gal抗原。非a-gal抗原物质与a-gal抗原同时在异种移植免疫排斥中成为攻击对象或被宿主免疫系统识别；亦可能在正常情况下是隐匿抗原，在a-gal被去除时成为主要靶抗原。一些特定细胞因子诱导表达的抗原可能是超急排斥的靶抗原。异种移植免疫天然抗体预先存在于受者血液循环中，是由CD5+B细胞产生的，Cramer发现在许多种属中，都是由同一种基因编码产生天然抗体，主要为IgM。天然抗体识别的靶抗原在不同种属间也是不同的。在猪－灵长目动物间，狒狒、猴等的天然抗体主要识别猪内皮细胞上的一种表面糖蛋白Gp115/135，而不是糖脂或磷脂。天然抗体与内皮细胞的结合可被不同的糖蛋白酶清除，主要的抗原决定簇是定位于糖蛋白联系的低聚糖上，即a-gal抗原。1，超急排斥反应（Hyperacuterejection,HAR）异种移植后数分钟到48小时内发生。比较公认的机制为：受者体内的天然抗体与供者器官内皮细胞上的异种抗原（a-gal）结合，激活受者补体系统（经典或替代途径），进而激活血管内皮细胞，激活血小板，引起血栓形成，使移植物缺血坏死。2，迟发性异种排斥反应（Delayedxenograftrejection,DXR）发生在异种移植术后4～5天，是在排除了发生HAR的因素后发现的一种排斥反应。病理特点是移植物局灶性缺血梗塞，广泛的微小血管内血栓形成，大量的单核细胞和少许自然杀伤细胞（NK）浸润。免疫荧光染色未发现免疫球蛋白、补体的沉积，不同于HAR、血管性排斥和T细胞介导的急性、慢性排斥后的病理改变。单核细胞参与DXR的机制：通过P－选择素、单核细胞、NK细胞与EC结合，导致EC激活，血小板聚集并激活，微血栓形成；尽管参与DXR的粒细胞数量少，但通过巨细胞粘附分子诱导，联合上述化学因子上调异种靶抗原，加重了DXR炎症反应。3，急性血管性排斥（Acutevascularxenograftrejection,AVR）,或称加速性急性排斥。见于近缘器官移植或控制了HAR的远缘移植。机理为异种移植物植入受体后，受体继发产生机体，与供体EC上的a-gal结合，致EC活化，引发血栓形成[10、11]。病理特点、移植物出血、水肿、实质坏死，有中性粒细胞及巨噬细胞浸润，与HAR类似。但免疫细胞检查无异种补体沉着，有异种IgM、LgG。抗体依赖的细胞毒作用可能在其中起作用。4，急性细胞性排斥、慢性排斥体液免疫仍是目前异种移植的难题，在沉有根本解决这一难题前，细胞免疫的研究尚未深入。但异种皮肤、胰岛移植被认为以细胞免疫为主，临床表现有如同种细胞免疫的相似处，实验也表明异种细胞识别包含直接和间接途径，但亦有其自身特点。同样，因异种移植尚无长期存活病例，但可预测在克服以上排斥反应后，慢性排斥可能发现。至于其机理和诱发因素，现在讨论为时尚早。5，异种移植中的GVHR早在二十世纪50年代就发现，将有免疫活性细胞的同种异体组织植入免疫系统被抑制的受体后，有的动物会“神秘”地死亡。尸检发现受者淋巴器官萎缩而无感染表现，以后在同种移植的患者中也发现类似情况，称为移植物抗宿主反应（GVHR）。随后在80年代未和90年代初，Mosier及Lubin先后报道了在有免疫缺陷的小鼠中植入人类外周血淋巴细胞，在小鼠体内建立人类免疫系统的模型中，观察到异种GVHR（XGVHR）。XGVHR的诱发条件：尽可能摧毁受者的免疫系统，使其免疫力极度低下，如应用先天免疫缺陷或生理性免疫低下的动物，术前给予受者免疫抑制剂或行TBI、BMT后给予受者IL－2促发XGVHD；然后经腹腔或静脉注射植入有免疫活性的异种淋巴细胞（如人类PBLC）。XGVHR的机制：1）细胞免疫：T细胞、NK细胞、巨噬细胞参与可XGVHR，其中还有CK的作用。但触发XGVHR的抗原是什么，信息传递过程中粘附因子，第二信号系统起什么作用，与同种GVHR机制有何异同等尚待进一步研究；2）体液免疫：在受体小鼠内植入的人类B细胞如能正常工作，则能产生针对小鼠的异种天然抗体XNA，从而发起对宿主的攻击。在XGVHR鼠肾小球中也检测出多克隆的人类Ig，这说明体液免疫参与了XGVHR，但具体方式及细节仍不清楚。XGVHR的病理特点：1)急性XGVHR时，受体鼠脾脏、骨髓、胸腺、肝脏、肾、小肠及皮肤均可见人类淋巴细胞浸润；2)慢性XGVHR的病理特征为广泛的血管周围炎，造血组织内主要以人CD8＋细胞浸润为主。6，适应（Accommodaton）某些病例中，如在移植前除去抗体，并维持无抗体状态达到一定时间，于是观察令人吃惊的现象，尽管循环抗体水平随即回升，并有补体的存在，而移植物却继续存活下去，不发生异种移植的超急排斥反应，这种抗体对抗原的“停战”状态称之为适应（Accommodaton）。适应是一种状态，其可能机制为：1)适应前后，受者体内的抗体在某些重要特征上发生了改变；2)在自然抗体清除或抑制时期，移植物内皮细胞表面表达的抗原性发生了变化；3)内皮细胞对两种抗体（天然抗体和适应后再产生的抗体）的反应不同。MHC在异种移植中的作用MHC为主要组织相容性复合物，在人类为人白细胞抗原HLA。MHC能够约束免疫细胞间的相互作用。早期研究发现，细胞毒性T细胞只能杀伤具有同一MHC表型的病毒感染的靶细胞，即T细胞在识别细胞表面抗体决定簇的同时，还必须识别细胞上的MHC分子。以后证实，Tc、MO、TH、B、靶细胞间相互作用也受同样的限制。具有同一MHC表型的免疫细胞间才能有效地相互作用，这一现象称为MHC限制性。同种移植中，外来抗原的呈递识别方式有两种：直接识别和间接识别。直接识别（directrecognition）又称同种限制性（allo-restriction），是指宿主T细胞表面的抗原受体识别自身肽－同种MHC，致极强的初次反应；间接识别（indirectrecognition）又称自身限制性（self-restriction），是指抗原呈递细胞APC将外源肽－自身MHC以复合物方式呈递移植抗原，其初次反应弱，但随着时间的推移逐步增强，对移植物产生特异性排斥。Yamada的研究表明，人类T细胞也能直接和间接识别猪的MHC（SLA－Ⅱ抗原），但由于种间差异，猪与人的相互作用不如人同种异体间紧密，故主要依靠间接途径呈递抗原，这也是异种MLR比同种MLR增殖反应低的原因。而不同型猪一人组合的MLR反应强弱不同，说明MHC的适配性在异种移植中起仍起主要作用，提示是否需要