13,14-微生物的生长及其控制.

第六章微生物的生长及其控制生长——微生物细胞吸收营养物质，进行新陈代谢，当同化作用异化作用时，生命个体的重量和体积不断增大的过程。繁殖——生命个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。发育——从生长到繁殖，是生物的构造和机能从简单到复杂、从量变到质变的发展变化过程，这一过程称为发育。群体生长——群体中个体数目的增加。可以用重量、体积、密度或浓度来衡量。（由于微生物的个体极小，所以常用群体生长来反映个体生长的状况）个体生长个体繁殖群体生长群体生长=个体生长+个体繁殖生长与繁殖的概念第一节微生物生长的测定第二节微生物的生长规律第三节影响微生物生长的主要因素第四节微生物培养法概论第五节微生物生长的控制第一节微生物生长的测定一、微生物的纯培养二、微生物生长的测定（一）微生物细胞数目的测定（二）微生物生长量的测定（三）丝状微生物菌丝长度的测定一、微生物的纯培养微生物在自然界中不仅分布很广，而且都是混杂地生活在一起。要想研究或利用某一微生物，必须把混杂的微生物类群分离开来，以得到只含一种微生物的培养。微生物学中将在实验室条件下从一个细胞或一种细胞群繁殖得到的后代称为纯培养。纯培养的分离，是研究和利用微生物的第一步，是微生物工作中最重要的环节之一。最常用的方法有稀释平板法、划线法、单细胞挑取法及利用选择培养基分离法等。纯培养的分离方法稀释倒平板法划线法选择培养基分离法单细胞挑取法稀释倒平板法（倾注法（混菌法）、涂布法）这是最常用的纯种分离法，先将待分离的材料作一系列的稀释(如1：10、1：100、1：1000、1：10，000……)，然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至45℃的琼脂培养基相混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，平皿上就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。划线法将已熔化的培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，用接种环沾取少许待分离的材料，在培养基表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物将随着划线次数的增加而分散，经保温培养形成菌落。划线开始的部分细菌分散度小，形成的菌落往往连在一起。由于连续划线，微生物逐渐减少，划到最后，常可形成单个孤立的菌落。这种单个菌落可能由一个细胞繁殖而来，故可获得纯培养。用其他工具如弯形玻璃代替接种环，在培养基表面涂布，亦可得到同样结果。此法较为简便。单细胞挑取法这种方法是从待分离的材料中挑取一个细胞来培养，从而获得纯培养。具体方法是将显微镜挑取器装置在显微镜上，把一滴菌悬液置于载玻片上，用安装在显微镜挑取器上的极细的毛细吸管，在显微镜下对准某一个单独的细胞挑取，再接种到培养基上培养。此法需要非常熟练的操作人员，多限于高度专业化的科学研究中采用。利用选择培养基分离法不同微生物需要不同的营养物质。有些微生物生长适于酸性环境，有些则适于碱性环境。各种微生物对不同的化学试剂如消毒剂(酚)、染料(结晶紫等)、抗生素及其他物质等具有不同的抵抗能力。利用这些特性，便可配制成适合于某种微生物生长而限制其他微生物生长的各种选择性培养基，以达到纯种分离的目的。另外，也可以将待分离的样品先进行适当处理，以消除不希望分离到的微生物。对一些生理类型比较特殊的微生物，为了提高分离机率，往往在涂布分离前先进行富集培养，其目的是提供一个特别设计的培养环境，以帮助所需的特殊生理类型的微生物的生长，而不利于其他类型微生物的生长。选择培养基分离法1.dilutesample1ml9ml101001000104105106107牛肉膏培养基土豆培养基高氏培养基微生物纯培养分离方法的比较稀释平板法既可定性，又可定量，用途广泛平板划线法方法简便，多用于分离细菌单细胞挑取法局限于高度专业化的科学研究利用选择培养基法适用于分离某些生理类型较特殊的微生物二、微生物生长的测定微生物特别是单细胞微生物，体积很小，个体的生长很难测定，而且也没有什么实际应用价值。因此，在微生物学的研究和应用中，通常是测定群体的增加量，即群体的生长。测定不同种类、不同生长状态微生物的生长情况，需要选用不同的指标。通常对单细胞微生物来说，既可测定细胞数目，又可测定生长量；而对多细胞微生物(尤其是丝状真菌)，则常以菌丝生长的长度等作为生长指标。二、计繁殖数－－适用于单细胞微生物或丝状微生物的孢子直接计数法－－总菌计数1、计数板计数法（常用）2、比例计数法间接计数法－－活菌计数1、平板菌落计数法2、液体稀释法3、厌氧菌菌落计数其他计数法1、比浊法2、膜过滤法血球计数板各种型号的全自动血球计数仪活菌计数的一般步骤（一）微生物生长量的测定－－适用于一切微生物直接法1、测体积法2、称重法间接法1、含氮量测定法2、DNA含量测定法3、其他生理指标法（三）丝状微生物菌丝长度的测定培养基表面菌体生长速率测定法培养料中菌体速率测定法单个菌丝顶端生长速率测定法第二节微生物的生长规律一、微生物的个体生长和同步生长二、单细胞微生物的典型生长曲线三、微生物的连续培养四、微生物的高密度培养一、微生物的个体生长和同步生长微生物在适宜的环境条件下，不断地吸收营养物质，并按照自己的代谢方式进行代谢活动，如果同化作用大于异化作用，则细胞质的量不断增加，体积得以加大，于是表现为生长。简单地说，生长就是有机体的细胞组分与结构在量方面的增加。同步培养技术：是指设法使某一群体中的所有个体细胞尽可能都处于同样细胞生长和分裂周期的一种培养方式。通过分析此群体在各阶段的生物化学特性变化，来间接了解单个细胞的相应变化规律。同步生长：通过同步培养的手段而使细胞群体中各个体处于分裂步调一致的生长状态的一种生长方式。获得微生物同步生长的方法选择法诱导法同步生长的细胞经过2~3个分裂周期后会丧失同步性。离心分离法过滤分离法膜洗脱法控制温度控制培养基成分抑制DNA合成法选择法又称机械筛选法，是通过物理学方法从随机、不同步群体中选择出同步的群体。此法可在不影响微生物代谢的情况下获得同步培养物。若微生物在相同发育阶段大小不一，则不适宜用此法。举例：过滤分离法、密度梯度离心法、膜洗脱（常用）等。诱导法诱导因子：不影响微生物生长，可特异性抑制细胞分裂，消除该抑制后，细胞同时出现分裂。此法会扰乱细胞的正常代谢举例：1、温度调整法；2、营养条件调整法；3、抑制DNA合成法（代谢抑制剂：）（抑制DNA合成法是利用代谢抑制剂阻碍DNA合成相当一段时间，然后解除其抑制，可达到同步目的。常用的代谢抑制剂：氨甲蝶呤、羟基尿素、5-氟脱氧尿苷、胸腺苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷等。）二、单细胞微生物的生长曲线多数细菌的繁殖速度很快。大肠杆菌在适宜的条件下繁殖48h，其子代总重可达2.2×1031g，这是一个巨大的数字。然而，实际情况是不可能的。那么，细菌的群体生长规律到底怎样呢?现象：开始有一短暂时间，细胞数量并不增加，随之细胞数目增加很快，继而细胞数又趋稳定，最后逐渐下降。如果以培养时间为横坐标，以细胞数目的对数或生长速度为纵坐标作图，可以得到一条曲线，称为生长曲线。微生物的典型生长曲线(growthcurve)总菌数活菌数培养时间/hⅡ.指数期Ⅲ.稳定期Ⅳ.衰亡期Ⅰ.延滞期细菌数目（个/ml）对数ⅡⅢⅣⅠ根据微生物的生长速率常数的不同，可将生长曲线大致分为四个时期：（一）延滞期(lagphase)延滞期出现的原因把少数单细胞微生物接种到新鲜的培养基中培养时，细胞并不立即进行分裂繁殖，微生物的增殖数为０，这时细胞需要合成多种酶，辅酶和某些中间代谢产物，因此要经历一个调整和适应过程。延滞期的特点1、生长速率常数为零；2、细胞形态变大或增长；3、细胞内的RNA含量增高，原生质呈嗜碱性；4、合成代谢十分活跃；5、对外界不良环境反应敏感。影响延滞期长短的因素1.菌种特性；2.接种龄；3.接种量；4.培养基成分缩短延滞期的方法1、接种对数生长期的菌种，采用最适菌龄；2、加大接种量；3、用营养丰富的天然培养基等。（二）指数期(exponentialphase)指数期的特点1、活菌数和总菌数接近2、生长速率常数最大，代时(generationtime，G)最短3、细胞进行平衡生长，细胞的化学组成及形态，生理特性比较一致4、酶系活跃，代谢旺盛该期的微生物生产中多被用做种子和科学试验材料x2x1t2t1培养时间细胞数/mlt2-t13.322(lgx2-lgx1)生长速率常数R=t2-t13.322(lgx2-lgx1)代时G=指数期生长的数学模型繁殖代数n=3.322(lgx2-lgx1)生长速率常数R：指细胞每小时的分裂次数。代时G：细胞每分裂一次所需的时间。R=1/G影响指数期微生物代时长短的因素菌种营养成分营养物浓度培养温度生长限制因子:凡处于较低浓度范围内可影响生长速率和菌体产量的某营养物。（三）稳定期(stationaryphase)稳定期的特点1、生长速率常数R等于零，活菌数达到最高峰，并保持相对稳定。2、微生物细胞内代谢物积累达到最高峰。3、芽孢杆菌这时开始形成芽孢。4、这是产物（菌体或与菌体生长相平行的代谢产物）的最佳收获时期。稳定期到来的原因1、营养物尤其是生长限制因子的耗尽2、营养物的比例失调3、有害代谢产物的积累4、pH值、Eh值等理化条件不适宜（四）衰亡期(declinephase)衰亡期的特点1、微生物死亡数大于增殖数，活菌数大大减少，群体衰落2、细胞出现多形态,大小不等的畸形,变成衰退型3、细胞死亡,出现自溶现象。4、有的微生物在此期合成或释放次生代谢物。5、芽孢杆菌在此期释放芽孢。三、微生物的连续培养将微生物置于一定容积的培养基中，经过培养生长，最后一次收获，此称分批培养(batchculture)。通过对细菌纯培养的生长曲线的分析可知，在分批培养中，培养基一次加入，不予补充，细菌的对数生长期不可能长时间维持。如果在培养器中不断补充新鲜营养物质，并及时不断地以同样速度排出培养物(包括菌体及代谢产物)，理论上讲，对数生长期就可无限延长。这种方法就叫连续培养法。连续培养方法的出现，不仅可随时为微生物的研究工作提供一定生理状态的实验材料，而且可提高发酵工业的生产效益和自动化水平。此法已成为当前发酵工业的发展方向。优点：缩短发酵周期；便于自动控制；产物质量均一缺点：菌种易退化；易染杂菌(一)恒浊连续培养不断调节流速而使细菌培养液浊度保持恒定的连续培养方法叫恒浊连续培养。在恒浊连续培养中装有浊度计，借光电池检测培养室中的浊度(即菌液浓度)，并由光电效应产生的电信号强弱变化，来自动调节新鲜培养基流入和培养物流出培养室的流速。(二)恒化连续培养控制恒定的流速，使由于细菌生长而耗去的营养物及时得到补充，培养室中营养物浓度基本恒定，从而保持细菌的恒定生长速率，故称恒化连续培养，又叫恒组成连续培养。第三节影响微生物生长的主要因素一、温度二、氧气三、pH一、温度影响微生物生长繁殖的最重要因素之一。就总体而言，微生物生长的温度范围较广，已知的微生物在-10～95℃范围内生长。而对某一具体微生物而言，只能在一定的温度范围内生长，且此温度范围有宽、有窄。生长温度三基点：任何微生物的生长温度总有最低生长温度、最适生长温度、最高生长温度。温度生长速度温度停止生长致死最低最高最适微生物按其最适生长温度范围可分为：嗜冷菌嗜温菌嗜热菌最适生长温度：即某微生物分裂代时最短或生长速率最高时的培养温度。不同微生物的最适生长温度是不一样的。应该着重指出：最适生长温度不一定是一切代谢活动的最适温度。嗜冷菌其生长温度范围在－10～20℃，最适生长温度为15℃或以下，它们常分布在地球两极地区的水域和土壤中。嗜冷机制：①酶系在低温下仍能起催化作用②细胞膜含较多的不饱和脂肪酸，在低温下仍具有通透性。嗜温菌绝大多数微生物属于这一类。最适生长温度在20～45℃之间，最低生长温度10～