13淀粉酶纯化与活性测定

淀粉酶纯化与活性测定一、实验目的1．了解淀粉酶对不同底物的专一性；2．了解温度对酶的影响；2．掌握测定淀粉酶活力的原理和基本方法。二、基本知识与原理1．酶的概念自然界中的一切生命现象都与酶的活动有关系。活细胞内全部的生物化学反应都是在酶的催化作用下进行的。如果离开了酶，新陈代谢就不能进行，生命就会停止。酶是生物体活细胞产生的具有特殊催化活性的生物大分子，包括蛋白质及核酸，又称为生物催化剂。绝大多数酶是蛋白质，少数的酶是RNA。2.酶的性质酶是生物催化剂，除了具有化学催化剂的特性（例如只需微量就可以使所催化的反应加速进行，而其本身的质和量都不发生变化）以外，还具有一些不同于化学催化剂的特性。（1）酶的催化能力远远超过化学催化剂；（2）酶具有高度的专一性：（3）同一般的催化剂相比，酶很容易失活。3．影响酶活力因素酶的催化作用，受到温度、pH和某些化合物等因素的影响。（1）温度的影响在一定的温度范围（0~40℃）内，酶催化作用速度随着温度的升高而加快。但超过60℃，绝大多数的酶就会失去活性。（2）pH的影响酶对环境中的pH十分敏感，只有在一定的pH范围内才能表现出活性，超过这个范围，酶就失活了。一般酶的最适pH在4~8之间。（3）激活剂和抑制剂的影响有些物质（大都是离子或简单的有机化合物），能够增强酶的活性；有些物质能够抑制酶的活性。5．淀粉酶淀粉酶能作用于淀粉中的α-1,4葡萄糖苷键，使淀粉分解为麦芽糖。反应方程式如下：2（C6H10O5）n+nH2OnC12H22O11但是不能作用于蔗糖分子的α-D吡喃葡萄糖的C1和b-D-呋喃果糖的C2之间的糖苷键。淀粉的还原性极小，而唾液淀粉酶（主要含α-淀粉酶）水解淀粉后形成的麦芽糖有还原性，能使3,5-二硝基水杨酸（DNS试剂）还原成棕色的3-氨基-5-硝基水杨酸。据此可以检验蔗糖和淀粉有无被唾液淀粉酶水解，从而了解酶作用的专一性。6.酶活力也称酶活性，是以酶在最适温度、最适pH条件下，催化一定的化学反应的初速度来表示。本实验是以一定量的唾液淀粉酶液，于37℃、pH6.8的条件下，在一定的初始作用时间里将淀粉转化为还原糖，然后通过与DNS试剂作用，比色测定，求得还原糖的生成量，从而计算出酶反应的初速度，即酶的活力。在一定范围内，反应液的棕色深浅与还原糖的含量成正比，在波长540nm处测定溶液的吸光度，根据标准液浓度得吸光度，便可求得样品中还原糖得含量。三、实验器材1．实验材料：淀粉酶液2．实验试剂：可溶性淀粉、二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、磷酸缓冲液（0.2mol/L，pH6.8）、1mg/ml标准麦芽糖溶液3．实验设备：洗瓶、试管架、玻棒、水浴锅、分光光度计四、实验步骤1．唾液淀粉酶的制备（1）提取：先用水漱口清洁口腔，然后含1小口（约5ml）蒸馏水于口中轻漱1~2min。（2）过滤：将口腔中的酶提取液用一层脱脂棉过滤。（3）稀释：取滤液1ml，用水定容至50ml。作为淀粉酶的样品。◆由于不同人或者同一人不同时间收集到的唾液淀粉酶的活性并不相同，稀释倍数可以是50~300倍，甚至超过此范围。2．唾液淀粉酶的专一性实验取4支试管，按表5.1编号并记录所观察到的颜色。表5.1唾液淀粉酶的专一性实验和酶活测定管号操作123455pH6.8缓冲液（ml）121121蔗糖溶液（ml）110000淀粉溶液（ml）001111淀粉酶液（ml）101000煮沸过的唾液（ml）000100标准麦芽糖溶液（ml）000001酶促反应摇匀，37℃水浴3minDNS试剂（ml）各2显色反应沸水浴5min颜色A500nm光吸收值3．唾液淀粉酶活力的测定用5号空白管座对照：在500nm处测定3、5管的吸收值。将数据填入表5.1。4.计算根据溶液浓度与光吸光值成正比的关系，即：A标准＝c标准则c（酶液管中麦芽糖浓度）＝A酶×c酶A酶c酶A标准（其中c为浓度，A为吸光值）本实验规定：在37℃、pH6.8的条件下，每3min水解淀粉释放1mg麦芽糖所需的酶量为1个酶活单位。总活力单位＝c酶×n酶（c酶为麦芽糖的浓度；n酶为稀释倍数）附：分光光度计的使用：（1）先了解仪器的各个操作旋钮的功能和电表的读数方法。（2）开启电源，指示灯亮，选择开关置于“T”，波长调置使用波长。打开比色皿暗箱盖（光门自动关闭），预热20min后。（3）将预先装好空白溶液和待测液的比色杯，依次放入暗箱内的比色皿架上。◆比色杯中所盛溶液不宜过满，大概2/3体积，若不慎使溶液流出比色杯外面，应用滤纸吸干，再用擦镜纸擦净后才能放入比色杯架内。◆手不能接触比色杯的光滑面，切忌用滤纸等物擦拭比色杯的光滑面。（4）打开暗箱盖，调节“0”旋钮，使数字显示为“00.0”。盖上暗箱盖，将对照液处于校正位置，使光电管受光，调节透光率“100”旋钮，使数字显为“100.0”。连续几次调整“00.0”和“100.0”，仪器即可进行测定工作。◆如果显示不到“100.0”，则可适当增加微电流放大器的倍率档数，但尽可能使用低倍率档，这样仪器有更高的稳定性。但改变倍率后必须按步骤4重新校正“00.0”和“100.0”。（5）将选择开置于“A”，调节吸光度调零旋钮，使得数字显示为“.000”，然后将待测样品移入光路，现实值即为吸光值。◆测定时尽量使光吸收值不要超过1。（6）测定完毕，将每个旋钮、开关和调节器等复原和关闭，拔掉电源插头。◆用完比色杯后立即用自来水冲洗比色杯，再用蒸馏水洗净，将比色杯倒立晾干；每套仪器所配套的比色皿，不能与其他仪器上的比色皿单个调换。五、实验结果记录1．计算酶活2．为什么酶促反应要在37℃水浴？沸水浴的目的是什么？3.本实验验证了酶的哪些特性？