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1第一章绪论——基因工程概况1、第一个实现DNA重组的人，现代基因工程的创始人——1972年，美国斯坦福大学医学中心的P.Berg2、基因工程诞生的元年——1973年，以科恩（Coher）和博耶（Boyer）建立的基因工程的基本模式为标志3、基因工程概念：按照人们事先设计的蓝图，在体外将不同来源的DNA分子进行剪切重组，与载体DNA形成镶嵌DNA分子（即重组DNA分子），然后将之导入宿主细胞，使之在宿主细胞中扩增表达，从而使宿主或宿主细胞获得新的遗传特性，或形成新的基因产物。理论依据：不同基因具有相同的物质基础、基因是可以切割的、基因是可以转移的、多肽与基因之间存在对应关系、遗传密码是通用的、基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代。基本技术路线主要内容（基因工程的上游操作过程可简化为：切、接、转、增、检）及基本要素。①从供体细胞中分离出基因组DNA，用限制性核酸内切酶分别将外源DNA（包括外源基因或目的基因）和载体分子切开（切）；②用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段接到载体分子上，形成DNA重组分子（接）；③借助于细胞转化手段将DNA重组分子导入受体细胞中（转）；④短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中（增）；⑤筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞（检）。要素：基因工具酶载体受体细胞7、基因工程的现实应用方面2第二章基因克隆所需的工具酶1、基因工程使用的工具酶的种类：限制性内切酶、连接酶和修饰酶，其中以限制性内切酶和DNA连接酶为主的多种工具酶的发现和应用，为基因操作提供了十分重要的技术基础。2、限制性核酸内切酶的类型（I、II、III类）命名（一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组成，第四个字母表示菌株（品系），即属名+种名+株名。）基本特性（回文序列，palindromes，一段自我互补的DNA顺序，有对称轴，即上下链从5’→3’方向所读的顺序完全一样）。通常双链DNA被酶切后可出现三种形式的末端：5’突出的粘末端；3’突出的粘末端；平末端。切割频率：识别序列的频率＝（1/4）n（n代表识别序列的碱基数目）3、同裂酶（isoschizomers）：有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶子序列，这类酶称为同裂酶。同尾酶（isocaudamer）：这一类的限制酶来源各异，识别的靶字序列也不相同，但产生相同的粘性末端。稀切酶：有较长的识别序列和富含GC或AT的识别序列的限制性核酸内切酶，在基因操作中使用稀切酶可获得大的片段。4、星性（Star）活性产生的原因某些限制性核酸内切酶在特定条件下，可以在不是原来的识别序列处切割DNA，这种现象称为Star活性。3在“非最适的”反应条件下（包括高浓度的核酸内切限制酶、高浓度的甘油、低离子强度、用Mn2+取代Mg2+以及高pH值等等），有些核酸内切限制酶识别序列的特异性便会发生“松动”，从其“正确”识别序列以外的其它位点切割DNA分子。5、DNA连接酶的连接机理：DNA连接酶是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5'-PO4与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的（T4DNA连接酶除外），而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。常用的DNA连接酶：大肠杆菌DNA连接酶、T4DNA连接酶、TscDNA连接酶。DNA片段的连接方法：互补黏性末端片段之间的连接、平末端片段之间的连接、片段末端修饰后进行连接。6、DNA修饰酶的种类和功能（1）末端脱氧核苷酸转移酶，功能是：简称末端转移酶，能够催化5′脱氧核苷三磷酸进行5′→3′方向的聚合作用；不需要模板存在就可以催化DNA分子发生聚合作用。（2）碱性磷酸酯酶，菌碱性磷酸酶（bacterialalkalinephosphatase，简称BAP）；小牛肠碱性磷酸酶（calfintestinalalkalinephosphatase，简称CIP），功能是：使DNA（或RNA）片段的5′-P末端转换成5′-OH末端。（3）T4多聚核苷酸激酶，从T4噬菌体感染的大肠杆菌细胞中分离出来，功能是：催化γ-磷酸从ATP分子转移给DNA或RNA分子的5′-OH末端。（4）甲基化酶，功能是：可使细菌DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤发生甲基化，形成5’-甲基胞嘧啶和6’-甲基腺嘌呤；5’-甲基胞嘧啶（Dcm甲基化酶识别CCAGG或CCTGG序列，在第二个胞嘧啶C的C5位置上引入甲基）；6’-甲基腺嘌呤（Dam甲基化酶可在GATC序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基）。常用的甲基化酶属于II型，它与相应的限制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不同。第三章基因克隆的载体1、载体：这种能与目的基因结合，且有完整的复制和转录功能的DNA大分子称之为载体。2、载体的分类按构建克隆载体DNA的来源分类：①质粒载体②噬菌体载体③病毒载体④质粒与病毒或噬菌体DNA组成的载体⑤质粒与染色体DNA片段组成的载体⑥其它克隆载体按克隆载体的用途分类：①cDNA克隆载体②转录载体③表达载体④普通载体4按应用对象分类：①原核生物基因克隆载体②酵母基因克隆载体③植物基因克隆载体④动物基因克隆载体3、作为一个理想的克隆载体DNA分子必须具备以下基本条件：①针对受体细胞的可转移性：携带外源基因片段进入受体细胞，并在细胞内稳定存在，这样可以使重组体可以稳定传代而不易丢失。②自主复制功能：能够在宿主细胞中存在并繁殖，有功能良好的复制子和启动子，使插入基因复制和表达（自主复制或整合到染色体DNA上随其复制而同步复制）；③具有多个限制性内切酶的切点，且切点是单一的，这样可将多个外源DNA片段插入其中；③具有容易检测的筛选标记；④载体DNA的分子量适当，可容纳较大的外源DNA片段，又可在受体细胞内扩增较多的拷贝；⑤在细胞内稳定性高，这样可以使重组体可以稳定传代而不易丢失。4、质粒的一般生物学特性①自主复制性：质粒DNA携带有自己的复制起始区（ori）以及一个控制质粒拷贝数的基因，因此它能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制。②不亲和性（不相容性）：在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。③可转移性：在天然条件下，很多天然质粒都可以通过细菌接合作用从一种宿主细胞内转移到另外一种宿主内。④显性质粒和隐蔽质粒：宿主因含某种质粒而呈现出新的性状，称为显性（表达型）质粒。反之称为隐蔽质粒。5、质粒克隆载体构建的基本原则①选用合适的出发质粒：含必备的元件，如ori、选择标记、克隆位点、启动子和终止子②正确获得构建质粒克隆载体的元件③组装合适的选择标记基因④选用合适的启动子⑤构建过程力求简单6、常用质粒①大肠杆菌质粒载体②病毒（噬菌体）载体（柯斯质粒的概念：一类人工构建的含有λDNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体，cosmid是cossitecarryingplasmid的缩写。）③人工染色体克隆载体种类（包括酵母人工染色体（YAC）、细菌人工染色体（BAC）、P1派生人工染色体（PAC）、哺乳动物人工染色体（MAC）和人类游离人工染色体（HAEC）。）7、多克隆位点（MCS）：一段用于插入外源DNA片段的特定区域，由一系列的紧密相连的限制性内切酶位点组成，而且每个限制性内切酶位点在整个载体中是唯一的，可以定向克隆防止载体自我连接。5第四章目的基因的分离1、目的基因的制备的方法①直接分离法②构建基因组文库分离法③构建cDNA基因文库分离法④聚合酶链式反应技术扩增目的基因⑤基因的化学合成比较基因组文库和cDNA基因文库的原理、构建、特点。基因组文库：（概念原理）用限制性内切酶切割细胞的整个基因组DNA，可以得到大量的基因组DNA片段，然后将这些DNA片段与载体连接，再转化到细菌中去，让宿主菌长成克隆。这样，一个克隆内的每个细胞的载体上都包含有特定的基因组DNA片段，整个克隆群体就包含基因组的全部基因片段的总和称为基因组文库。（构建的基本步骤）①细胞染色体大分子DNA的提取和大片段DNA的制备；②载体DNA的制备；③载体与外源大片断DNA的连接；④体外包装及基因组DNA文库的扩增；⑤重组DNA的筛选和鉴定。（特点）cDNA基因文库：（原理）提取组织细胞的全部mRNA，在体外反转录成cDNA，与适当的载体常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。（构建步骤）①细胞总RNA的制备及mRNA的分离与完整性的确定；②cDNA第一条链与双链cDNA的合成及克隆；③cDNA与载体的连接、噬菌体颗粒的包装及转染或质粒的转化与鉴定等。（特点）优点：特别适用于某些RNA病毒的基因组结构研究，筛选比较简单易行，目的基因的选择中出现假阳性的概率比较低，可用于在细菌中能进行表达的基因的克隆，可用于真核细胞mRNA的结构和功能研究；缺点：cDNA文库所包含的遗传信息要远远少于基因组DNA文库，不能直接获得基因的内含子序列和基因编码区外大量的调控序列的结构与功能方面的信息，低丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例比较低。2、基因组DNA文库、cDNA基因文库的概念、构建过程及特点基因组DNA文库：（概念）从生物组织细胞提取出全部DNA，用物理方法或酶法将DNA降解成预期大小的片段，然后将这些片段与适当的载体连接，转入受体细菌或细胞，这样每一个细胞接受了含有一个基因组DNA片段与载体连接的重组DNA分子，而且可以繁殖扩增，许多细胞一起组成一个含有基因组各DNA片段克隆的集合体。（构建过程）①细胞染色体大分子DNA提取和大片段的制备；②载体DNA的制备；③载体与外源大片段的连接；④体外包装及基因组DNA文库的扩增；⑤重组DNA的筛选和鉴定。（特点）计算重组子数目的公式，即：N=ln（1-P）/ln（1-f）式中N为所需的重组子的数目；f为单个重组体中插入片段平均大小与基因组DNA总量之比；P为选出某一基因的概率（通常期望为99%）。-珠蛋白基因为例，分子量约为1.5Kb-珠蛋白基因的基因组文库（筛选到的可能性为99％），这个基因组文库要多大？3、PCR原理、步骤6原理：DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。步骤：①DNA变性（90℃-96℃）；②退火（25℃-65℃）；③延伸（70℃-75℃）。4、基因的化学合成方法：全片段酶促连接法+酶促填充法5、天然DNA是指存在于生物体内的DNA，包括：染色体DNA、病毒和噬菌体DNA、质粒DNA、线粒体和叶绿体DNA。6、分离提取核酸的主要步骤：生物材料的准备、裂解细胞、分离和抽提。第五章重组基因导入受体细胞1、受体细胞：又称为宿主细胞或寄主细胞(hostcell)等，从实验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。2、作为基因工程的宿主细胞必须具备以下特性：①便于重组DNA分子的导入；②能使重组DNA分子稳定存在于细胞中；③便于重组体的筛选；④遗传性稳定高，易于扩大培养或发酵生长；⑤安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染；⑥有利于外源基因蛋白表达产物在细胞内的积累，或促进外源基因的高效分泌表达。⑦在遗传密码的应用上无明显偏倚性；⑧具有较好的翻译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达；⑨在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。3、基因工程中常用的受体细胞类型：原核生物细胞：至今被用作受体菌的主要有大肠杆菌、枯草杆菌、蓝细菌（蓝藻）等。真核生物细胞（真菌细胞、植物细胞