13高效液相色谱法(改动)

分析化学教程第二十章高效液相色谱法(1)§20.1概述§20.2高效液相色谱法的分类与基本原理20.2.1高效液相色谱法的分类20.2.2基本原理§20.3各类高效液相色谱法20.3.1液－固吸附色谱法20.3.2液－液分配色谱法20.3.3化学键合相色谱法20.3.4其他色谱法§20.4固定相20.4.1液－固色谱固定相20.4.2化学键合相20.4.3其他固定相§20.5流动相（溶剂系统）20.5.1分离方程式20.5.2Snyder溶剂分类20.5.3正相洗脱与反相洗脱20.5.4洗脱方式20.5.5流动相最优化方法简介§20.6高效液相色谱仪20.6.1输液泵20.6.2色谱柱与进样器20.6.3检测器20.6.4超高效液相色谱仪§20.7定性、定量分析方法20.7.1定性分析方法20.7.2定量分析方法高效液相色谱法概述•高效液相色谱法HPLC（highperformanceliquidchromatograph）高压输液泵高效固定相高灵敏度检测器•高效液相色谱法与经典液相色谱法的比较见表•高效液相色谱法与GC的比较见表高效液相色谱法的分类与基本原理20.2.1高效液相色谱法的分类按固定相的聚集状态：LLC和LSC按分离机制：分配、吸附、离子交换（IEC）、空间排阻（SEC）、亲合（AC）、手性（CC）、胶束（MC）、电色谱法（EC）。HPLCLSCLLCNLLC和RLLCBPC（狭）RBPCNBPCISC一般RBPCPICIEC一般IECICAA（氨基酸分析法）SECGPC和GFCAC（亲和）MC（胶束）CC（手性）20.2.2高效液相色谱法的基本原理HPLC的范氏方程：项、传质阻力相涡流扩散项、纵向扩散uDdDdDduD2d2Hs2fsm2psmm2pmmp阻力项。质阻力相和固定相传质力项、滞留流动相的传括流动相的传质阻其中，传质阻力项又包讨论：涡流扩散项：填料和填充均匀程度高效液相色谱柱的装填纵向扩散项mD2BTDm项忽略大低，流动相柱温u/BT传质阻力项m2psmmDdCC和TDm且柱效，nHCdp柱效，nHDm，柱阻，但易产生气泡TCDTm）（忽略固定相传质阻抗smmssmmCCCCCC温度一般为室温选甲醇、乙腈粘度小的溶剂uDdDdm2psmm2pm粒径综上所述，HPLC应采用：1)采用小粒径、窄粒度分布的球形固定相，首选化学键合相，用均浆法装柱；2）采用低粘度流动相，低流速（1ml/min)；3）柱温一般以25～35度为宜。太低，则流动相的粘度增加，温度高易产生气泡。流速分析型HPLC一般流量为1mL/min。各类高效液相色谱法20.3.1液－固吸附色谱法•分离机理溶质分子与流动相分子竞争吸附吸附剂表面吸附活性中心，靠溶质分子的分配系数（容量因子）不同而分离。影响容量因子的因素溶质分子的极性溶剂的极性硅胶的活性若以硅胶为固定相：洗脱剂：以烷烃为底剂，加适量极性调整剂组成的二元或三元流动相。流动相应该不含水。20.3.2液－液分配色谱法•分离机理靠样品组分溶入固定相与流动相达到“平衡”后分配系数的差别而分离。正、反相液－液色谱法注意流出顺序。目前，物理涂渍的液－液色谱几乎已被化学键合相所取代。20.3.3化学键合相色谱法将固定液的官能团键合在载体表面，就构成化学键合相。以化学键合相为固定相的色谱法称为化学键合相色谱法，简称键合相色谱法（bondedphasechromatograph，BPC）化学键合相的优点均一、稳定；不易流失，使用周期长；柱效高；重现性好。•反相键合相色谱法（RBPC或RHPLC）固定相：在载体表面键合含弱极性或中等极性的基团，如十八烷基硅烷（C18）（ODS柱）、辛烷基（C8）、甲基（－CH3）、苯基等。流动相：以水做主体，加适量的极性调节剂增加选择性如甲醇、乙腈、四氢呋喃等。出峰顺序：极性强的组分先出柱，极性弱的组分后出柱。分析对象：分离非极性至中等极性的各种分子型化合物。影响保留时间的因素：溶质的分子结构：极性越弱，保留时间越长。流动相的表面张力、介电常数和pH值：对于二元或多元体系改变溶剂的配比可改变流动相的表面张力和介电常数。通常，流动相中有机溶剂含量增加，k变小。例如：在水－甲醇体系中增加甲醇的量，可降低表面力和介电常数，使容量因子变小。•正相键合相色谱法固定相：在载体表面键合含中等极性或较强极性的基团，如氰基（－CN）、氨基（—NH3）、或二羟基等。流动相：以非极性或弱极性的溶剂如己烷、庚烷等为主体，加适量的极性调节剂增加选择性如乙醚、氯仿、二氯甲烷等。出峰顺序：极性弱的组分先出柱，极性强的组分后出柱。影响保留时间的因素：键合相的种类、流动相的强度、试样的性质。流动相的极性增强，洗脱能力增加，保留时间缩短。适应范围：分离溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物。•反相离子对色谱法（RPIC）msB]AB[]AB[Ksmmm)A(B)A(BAB写成通式：选择性。值和分离的变种类和浓度，就可以改值、离子对试剂的改变流动相的KpH表：反相离子对色谱的离子对试剂序号反离子种类主要应用对象1季铵盐（如四丁基铵磷酸盐TBA、溴化十六烷基三甲基铵（CTAB）强酸、弱酸、磺酸染料、羧酸、氢化可的松及其盐2叔铵（如三辛铵）磺酸盐、羧酸等3烷基磺酸盐（如甲基、戊基、己基、庚基、樟脑磺酸盐）强碱、弱碱、儿茶酚胺、鸦片碱等4高氯酸胺5烷基磺酸盐（如十二烷基磺酸盐、正庚烷基磺酸钠（PICB7)与3类似，选择性不同离子对色谱法的适用对象：用于有机酸、碱、盐的分离，以及用离子交换色谱法无法分离的离子型和非离子型化合物的混合物的分离。•离子抑制色谱法（ionsuppressionchromatograph，ISC）在反相色谱法中，通过向流动相加入少量弱酸（常用乙酸）、弱碱（常用氨水）或缓冲盐（常用磷酸盐及乙酸盐）来调节流动相的pH，抑制样品组分的离解，增加它在固定相中的溶解度，以达到分离有机弱酸、弱碱的目的，这种技术称为离子抑制色谱法。调节pH范围：2～7.5pH8.0破坏键合相与载体的结合pH2.0腐蚀柱子离子抑制色谱法适用：弱酸碱物质pKa=3～7弱酸；pKa=7～8弱碱；两性化合物。20.3.4其他色谱法•离子色谱法IonChromatography，简称IC传统离子交换色谱存在着两个难于解决的问题：a.需要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长；b.洗脱后的组分缺乏灵敏、快速的在线检测方法。离子色谱的创始人是H.Small。1975年提出抑制型离子色谱法。以分析F-、Cl-等阴离子为例：交换柱装OH型阴离子交换树脂，抑制柱内装H型的强酸性阳离子交换树脂。流动相是氢氧化钠或碳酸氢钠组成的稀溶液。XNaOHNROHNaXNR4-4-44OHNaXNRXNaOHNRXHNaSORXNaHSOROHNaSOROHNaHSOR33233•手性色谱法（chiralchromatography）～是利用手性固定相或手性流动相添加剂分离分析手性化合物的对映异构体的色谱法。•环糊精色谱法（CDC）根据环糊精与手性分子的镶嵌关系分离异构体。胶束色谱法（MC）该系统具有固定相－流动相－胶束－固定相，3个界面、3个分配系数，具有较好的选择性。•亲合色谱法（Affinitychromatograph）利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。固定相20.4.1化学键合相色谱法的固定相键合相（bondedphase；BP）：采用化学反应的方法将官能团键合在载体表面所形成的固定相。载体的类型：a.硅胶又有表面多孔型（即薄壳型）和全多孔微粒型。厂商：Porasil、Zorbel4、Lichrosorb系列，上海试剂一厂的堆积硅珠、青岛海洋化工厂的YWG系列、天津试剂二厂的DG系列厂商：Zipax、CorasilⅠ和ⅡVydac、Pellosil以及上海试剂一厂的薄壳玻璃珠。无定形球形全多孔硅胶（废弃）b.其他金属氧化物制备硅胶载体的好处。硅胶载体的不足：在碱性介质中（pH8）不稳定；在孔隙中大分子扩散困难，降低柱效；硅胶表面上的剩余硅羟基对分离有影响。目前研制的基质有：氧化铝、氧化锆、氧化钍和氧化钛。主要掌握正相和反相键合相：键合的基团的极性及适用情况。表：反相HPLC常用的化学键合相类型牌号名称官能团粒度/μm形状说明长链YWG-C18H37C18硅烷10非球形PartisilODSC18硅烷5，10非球形5％CZprbaxODSC18硅烷6球形15％C短链LiChrosorbRP-8C8硅烷5，10非球形13％～14％CYWGC6H6苯基硅烷10非球形7％CLiChrosorbRP-2二甲基硅烷5，10非球形5％C•键合相的性质和特点含碳量：指键合在硅胶表面上的烷基所含碳的质量分数，随链长增长，从3％～22％。覆盖度：指硅胶被键合后，在硅胶中的有效羟基与硅烷试剂反应的程度，在键合后有时还用短链的硅烷试剂与剩余和新产生的羟基反应，使羟基全部被”帽盖“（即封尾）而不起作用。键合相的特点：使用过程中不流失；化学稳定性好；适于梯度洗脱；载样量大。流动相（溶剂系统）HPLC对流动相的要求：不与固定相反应；对试样有适宜的溶解度，k在1～10之内，最好在2～5之间；与检测器相适应；纯度高，粘度小。使用前滤过，脱气。20.5.1分离方程式22k1k14nR讨论：α主要受溶剂种类的影响；在溶剂组成确定后，k主要由溶剂的配比所左右。20.5.2Snyder溶剂分类Snyder选择了3个参考物质，用于检验溶剂的3种分子间作用力，分别用Xe、Xd、Xn表述。表：参考物与被检溶剂间的作用力参考物乙醇（质子给予体）二氧六环（质子受体）硝基甲烷（强偶极）被检溶剂的作用力类型质子受体作用力(Xe)质子给予体作用力(Xd)强偶极作用力(Xn)描述溶剂极性用Snyder提出的溶剂极性参数P'来衡量。表：常用溶剂的极性参数和选择性参数溶剂P'XeXdXn正戊烷0.0---乙醚2.80.530.130.34二氯甲烷3.10.290.180.53氯仿4.10.250.410.33甲醇5.10.480.220.31可将81种色谱溶剂，按Xe、Xd、Xn在三角形坐标图上的相邻关系分为8类。选择不同组别的溶剂，分子作用力不同，容易使α改变，利于分离。20.5.3正相洗脱与反相洗脱溶剂洗脱强度指流动相中溶剂的洗脱能力,它不仅与流动相，而且与固定相的极性有关。在正相色谱中,“溶剂洗脱强度”与溶剂极性成正比；而在反相色谱中，溶剂极性越大,洗脱能力越小。反相键合相色谱法的溶剂强度用另一强度因子S表示。表：反相色谱常用溶剂的强度因子S水甲醇乙腈丙酮二噁烷乙醇异丙醇四氢呋喃03.03.23.43.53.64.24.5混合液设计统计技术：根据溶剂选择性分组，选具有显著选择性差异的溶剂。反相：水为底剂，甲醇、乙腈和四氢呋喃为选择性溶剂。正相：已烷或戊烷为底剂，乙醚、氯仿和二氯甲烷为选择性溶剂。混合溶剂的强度in1iiPP混in1iiSS混20.5.4洗脱方式•等度洗脱：在一个分析周期内流动相组成保持恒定，适合于组分数目较少、性质差别不大的试样。•梯度洗脱（程序洗脱）在一个分析周期内程序程序控制改变流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH值等，可使一个复杂样品中性质差异很大的组分，能在各自适宜的分离条件（容量因子k适宜）下分离。梯度洗脱能缩短分析时间、提高分离度、改善峰形、提高检测灵敏度。高效液相色谱仪总图高压泵主要部件之一，压力：150～350×105Pa。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性梯度淋洗装置外梯度:利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度:一台高压泵,通过比例调节