14经典液相色谱法2-平面色谱分析

平面色谱法18.4.1平面色谱法的分类•定义和分类平面色谱法(planechromatography)是在平面上进行分离的一种色谱方法，主要包括薄层色谱法、纸色谱法和薄层电泳法。薄层色谱法：将固定相均匀涂布在表面光滑的平板上，形成薄层而进行色谱分离和分析的方法。按分离原理又可分为：吸附薄层色谱法分配薄层色谱法分子排阻色谱法纸色谱法：将固定相放在纸上，以纸做载体进行点样、展开、定性、和定量的液-液分配色谱法。20世纪40年代产生应用于生化医药学方面的微量分析。20世纪60年代后，应用减少。薄层电泳法带电荷的被分离物在纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶及聚丙稀酰胺凝胶等惰性介质上，向与其相反的电极方向，以不同的速度迁移而实现分离。•薄层色谱法的特点：分离能力强，斑点集中。灵敏度高，几微克，甚至几十纳克的物质也能检出。展开时间短，一般只需十至几十分钟。一次可以同时展开多个试样试样预处理简单，对被分离物质性质没有限制。点样量较大，可点成点或条状。所用仪器简单，操作方便。•定性参数比移值0fllR原点到溶剂前沿的距离心的距离原点到组分斑点质量中18.4.2平面色谱法参数02f01fllRBllRA物质的物质的如图：。～围，最佳范～常用范围，值的范围为5.03.08.02.01R0Rff相对比移值Rr参被测（参）（被测）中心的距离原点到参考物斑点质量心的距离原点到组分斑点质量中llRRRffr讨论可消除系统误差，提高重现性和可靠性；相对比移值范围可以大于或小于1。•相平衡参数推导比移值与分配系数的关系，，溶质流出的时间为流出的时间为的色谱柱，溶剂，则对于一根长度为度为，溶质流动的速假设溶剂流动的速度为u/Lu/LLuu00已知色谱过程方程：10)VVK(ttmsR)uutuutllR000f（定时展开在薄层色谱中k11VVK11Rmsf可知ms000RVVK1uuu/Lu/Ltt（等距展开）fRkK或k11VVK11RmsfK趋近0，Rf趋近1，组分不被固定相保留。K趋近∞，Rf趋近0，组分停留在原点，完全被固定相保留。讨论Rf与K有关，即与组分性质（溶解度）以及薄层板和展开剂的性质有关。色谱条件一定，Rf只与组分性质有关，是薄层色谱基本定性参数，说明组分的色谱保留行为。•分离参数分离度点的宽度。为斑、，为两斑点中心间的距离心的距离，分别为原点至两斑点中、2112WWdll212112WW/d2WW/ll2R分离数色谱斑点数。纳的两种组分斑点之间能容和时，在为定义在相邻斑点分离度1R0R1.177ff二者由外推法获得。时组分的半峰宽，和为、其中，10Rbb1bb/lSNf10100SN越大，说明板的容量越大。18.5薄层色谱法•主要类型吸附薄层色谱法分配薄层色谱法分子排阻色谱法正相色谱法反相色谱法18.5.1吸附薄层色谱的吸附剂和展开剂•吸附剂最常用的是硅胶、氧化铝、聚酰胺、纤维素、葡聚糖、磷酸钙、磷酸镁、硅酸钙镁等。硅胶：SiO2·H2O结构：内部——硅氧交联结构→多孔结构表面——有硅醇基→吸附活性中心→氢键作用表：硅胶的活度与含水量硅胶含水量％活性级别氧化铝含水量％0Ⅰ05Ⅱ315Ⅲ625Ⅳ1038Ⅴ15适用范围：硅胶表面的pH约为5，适合分析酸性或中性物质。硅胶的类型：硅胶H：不含黏合剂，铺成硬板需另加粘合剂。硅胶G：是硅胶和锻石膏混合而成。硅胶GF254：含锻石膏和无机荧光剂，即锰激活的硅酸锌(Zn2SiO4:Mn),在254nm紫外光下呈强烈黄绿色荧光背景。购买时注意：规格（主要是种类、活度级别和粒度）常规：10～40μm高效：5μm或10μm氧化铝碱性氧化铝、中性氧化铝、酸性氧化铝使用时可不加黏合剂，也可加煅石膏或CMC等黏合剂；通常使用活性级别Ⅱ～Ⅲ级。•展开剂常见溶剂的极性由强到弱的顺序：水酸吡啶甲醇乙醇正丙醇丙酮乙酸乙酯乙醚氯仿二氯甲烷甲苯苯三氯乙烷四氯化碳环己烷石油醚如何选择吸附剂和展开剂？用“竞争吸附”解释被分离物质的极性吸附剂的活度展开剂极性大小大小大小防止吸附太牢，Rf太小防止Rf太大开展实验时，可以选用单一溶剂展开，再根据Rf的大小，进一步调整展开剂的种类或选用二元、三元展开剂。分离酸性物质，可在展开剂中加入少量酸性溶剂，如甲酸、乙酸等分离碱性物质，可在展开剂中加入少量碱性溶剂，如氨水、乙二胺等。例如：用氯仿展开时，如果Rf值太小，则可加入极性___的展开剂，如_____。如果Rf值太大，可加入极性____的展开剂，如_______________。环己烷、石油醚小乙醇大18.5.2薄层色谱操作方法可分制板、点样、展开和显色四个步骤。•薄层板的制备软板的制备硬板的制备硬板加了粘合剂，常用的粘合剂有羧甲基纤维素钠(CMC-Na)和锻石膏(CaSO4·1/2H2O)两种。硅胶-CMC板制备取羧甲基纤维素钠5~7g,加1000ml水，加热使溶解，放置澄清，取上清液100ml,分次加入硅胶约33g,调成糊状。去除气泡后，将糊状的吸附剂倒在清洁的玻璃板上，使均匀涂布于整块玻璃板上，平放自然晾干，105℃活化1h，置干燥器中保存备用。点样a.样品溶液的制备一般选用易挥发，与展开剂极性相似的有机溶剂，如甲醇、丙酮、乙醇等。配制样品液浓度为0.01%~0.1%。目的：使点样后溶剂能迅速挥发，减少色斑的扩散。b.点样量和点样工具点样毛细管，微量注射器点样量一般以几微升为宜，毛细管大约1cm左右。点样斑点直径以2~4mm为宜。c.点样方法吸取一定量的样液，轻轻接触于薄层的点样线上，点样线一般距薄层底边1.5~2cm，点间距约0.8~1.5cm(新药典规定为1.5~2.0cm)。点样后形成的原点面积越小越好，一般原点直径不超过2~4mm为宜。展开和展开剂的流速展开先预饱和。展开前，将薄层板置于盛有展开剂的色谱缸内饱和15～30min,此时薄板不与展开剂直接接触，当色谱缸内展开剂蒸汽、薄层与缸内大气达到动态平衡时，即饱和时，再将薄层板浸入展开剂中，称预饱和。边缘效应：指点在薄层板上的同一物质，薄板边缘的Rf值高于中部的Rf值的现象。展开剂的流速UfktLktLtL2000或据测有：，，所用时间为离为设展开剂前沿移动的距02/12/10f0L2ktk21dtdLUL求导：对触角。剂与固定相两相间的接为展开为展开剂粘度，展开剂表面张力，为为平均颗粒直径，为渗透常数，有关。变长而变慢，并与随可见，p0p00fdkcosdk2kkLU实际情况比上面分析的要复杂的多。总之，薄层色谱过程中展开剂的流速是空间、时间的复杂函数。显色显色方法：a.在日光下观察，划出有色物质的斑点位置。b.在紫外灯下观察有无暗斑或荧光斑点，并记录颜色、位置、强弱。能发荧光的物质或少数有紫外吸收的物质可用此法检出。c.荧光薄层板检测。d.显色剂显色。适用于无色，又无紫外吸收的物质。薄层色谱常用的通用型显色剂有碘、硫酸溶液、荧光黄溶液等。18.5.3定性和定量分析•定性分析依据：Rf值。用已知标准物质作对照，在多种展开系统中比较Rf值的大小。或与其它分析方法联用。•定量分析洗脱法用溶剂将斑点中的组分洗脱下来，再用适当的方法进行定量测定。斑点需预先定位。直接定量法：目视比较法：将一系列已知浓度的对照品与试样溶液点在同一薄层板上，展开并显色后，…薄层扫描法：用一定波长、一定强度的光束照射薄层上的斑点，用仪器测量照射前后光束强度的变化，从而求得物质含量的方法。精密度为±5%。双波长型薄层扫描仪测定方法：透射法和反射法。扫描方法：线形扫描和曲折形扫描λ1λ2CHLPPMPM双波长薄层扫描光学线路示意图18.5.4高效薄层色谱法(highperformancethinlayerchromatography；HPTLC)高效薄层色谱的分离效率比经典薄层色谱提高三倍，每分钟可分离5个以上组分，最多可分离40种组分。检出灵敏度提高，分析时间缩短。高效薄层色谱法与经典薄层色谱法在吸附剂粒度等方面不同。表：TLC与HPTLC的比较参数TLCHPTLC板尺寸(cm)20×2010×10颗粒直径(μm)10~405,10颗粒分布宽窄点样量(μl)1~50.1~0.2有效塔板数6005000展开距离(cm)10~153~6展开时间(min)30~2003~20最小检测量：吸收(ng)1~50.1~0.5荧光(pg)50~1005~1018.6纸色谱法18.6.1纸色谱法的分离原理～是以纸为载体的色谱法，分离原理属于分配色谱的范畴。固定相：纸纤维上吸附的水分。(或甲酰胺、缓冲液等滤纸可以吸留的物质。)流动相：不与水相混溶的有机溶剂。或可与水混溶的溶剂。paperchromatography分离原理：纸色谱法可以看成是溶质在固定相和流动相之间连续萃取的过程。依据溶质在两相间分配系数的不同而达到分离的目的。常用比移值Rf来表示各组分在色谱中的位置。Rf值与化学结构的关系值小（水为固定相）分配系数大强化合物极性大或亲水性fR值大（水为固定相）分配系数小强化合物极性小或亲水脂fR化合物的极性应根据整个分子及组成分子的各个基团来考虑。CHOHCOHHOCHHCOHHCOHCH2OHCHOHOCHHOCHHCOHHCOHCH3CHOCH2HCOHHCOHHCOHCH3葡萄糖鼠李糖洋地黄毒糖表：三种六碳糖的Rf值糖溶剂系统123葡萄糖0.030.170.10鼠李糖0.270.420.44洋地黄毒糖0.580.660.88溶剂系统1.正丁醇－水2.正丁醇－乙酸－水（4：1：5）3.乙酸乙酯－吡啶－水（25：10：35）18.6.2纸色谱法的实验条件色谱纸的选择a.要求滤纸质地均匀，应有一定的机械强度。b.纸纤维的松紧适宜。c.纸质应纯，杂质量要小，无明显的荧光斑点。薄纸定性，厚纸制备或定量。Rf值相差小慢速滤纸大快速滤纸固定相：纸纤维吸附的水滤纸纤维有较强的吸湿性，通常含20%~25%的水。其中有6%~7%的水是以氢键缔合的形式与纤维素上的羟基结合在一起。一般条件下较难脱去。所以为固定相。纸纤维是一个惰性载体。在分离一些极性较小的物质，为了增加其在固定相中的溶解度，常用甲酰胺或二甲基甲酰胺、丙二醇等作为固定相。分离酸、碱性物质，常将纸条浸过缓冲溶液。展开剂的选择选择依据：根据被分离物质在两相中的溶解度和展开剂的极性来考虑。在流动相中的溶解度较大的物质将会移动得快，具有较大的比移值；对极性物质，增加展开剂中极性溶剂的比例，可以增大比移值，增加非极性溶剂的比例，可以减少比移值。常用展开剂：水饱和的正丁醇、正戊醇、酚等，即含水的有机溶剂。为了防止弱酸、弱碱的离解，加入少量的酸或碱。如甲酸、醋酸、吡啶等。纸色谱的操作步骤有点样、展开、显色、定性定量分析几个步骤。复习题1、在硅胶薄层板A上，以苯－甲苯（1:3）为展开剂，某物质的Rf值为0.50，在硅胶板B上，用相同的展开剂，此物质的Rf值为0.40，问哪块板的活度大？2、用薄层色谱法分离某样品，先用氯仿展开，各组分的Rf太大，可在氯仿中加入一定比例的（c），以使Rf值在合适的范围。A.甲醇B.丙酮C.环己烷D.氨水3、在薄层色谱中，以硅胶为固定相，有机溶剂为流动相，迁移速度快的组分是（b）A.极性大的组分B.极性小的组分C.挥发性大的组分D.挥发性小的组分4、一个化合物当用丙酮为流动相时，Rf太大，如用氯仿为流动相时，此化合物的Rf会改善吗？5、吸附薄层色谱中，欲使被分离组分的Rf减小，一般可采用什么方法？6.在某色谱分析中得到如下数据：保留时间tR=5.0min，死时间t0=1.0min，固定液体积Vs=2.0ml，流动相流速F=50ml/min。计算1）容量因子；2）分配系数；3）死体积；4）保留体积。7.在色谱法的分类中，如按流动相的状态可将色谱分为气相色谱法、液相色谱法和超临界流体色谱法。如按操作形式可将色谱分为柱色谱法、平板色谱法、毛细管电泳法等。如按分离机制可将色谱分为吸附色谱法、分配色