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菌种与种子扩大培养1.生长过程中如何保持菌种优良特性？如何判断和处理菌种过程中污染和衰退问题？通过菌种保藏。保藏方法主要有斜面低温保藏法、石蜡油封保藏法、砂土保藏法、硅胶保藏法、冷冻干燥法、液氮超低温冻结法等。判断方法：镜检；划线分离。防止菌种衰退的方法：（1）尽可能满足其营养条件、培养条件，避免有害因素引起菌种衰退（2）尽量减少转代次数（3）采用幼龄菌接种。菌种复壮方法：（1）分离复壮（2）若单菌落分离不行，可改变培养条件，或两者结合进行复壮（3）诱变因素处理，再进行单菌落分离。2.扩大培养分级要求（包括原则）种子罐级数的确定取决于菌种的性质（如菌种传代后的稳定性）；孢子数、孢子发芽及菌体繁殖速度；所采用发酵罐的容积。要求与原则：（1）种子罐级数越小越好，有利于简化工艺，便于控制，减少染菌机会；减少消毒、值班工作量和因种子罐生长异常而造成的波动。（2）种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率，增加染菌机会（3）虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定，但也随着工艺条件改变而适当调整，如改变种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。3.成熟种子一般有哪些要求和影响因素种子的要求：总量与浓度能满足要求；生理状况稳定，个体与群体；活力强，移种至发酵后，能够迅速生长；无杂菌污染。影响因素：培养基（提高产量，组成简单，来源丰富，价格便宜，取材方便等）；种龄与接种量（菌种的对数生长期为宜）；温度；pH值；通气与搅拌；泡沫；染菌的控制；种子罐级数。4.种子连续培养和分批培养主要优缺点连续培养（发酵）：发酵过程中一边补入新鲜的料液，一边以相同的流速放料，维持发酵液原来的体积。优点：（1）设备体积可减小，能合理地按照发酵阶段实行连续化（2）操作时间可缩短，总体操作管理方便（3）中间产物和最终产物稳定；生产系统化；节约生产成本（4）对微生物的生理、生态和反应机制较易分析缺点：（1）营养成分的利用较分批发酵差，产物浓度较分批发酵低（2）杂菌污染机会大（3）存在菌种变异问题（4）设备操作上须与工艺系统中其它工段保持连续一致分批培养：在一密闭系统内加入限量营养物质，接入少量菌种培养，在特定条件下只完成一个生长周期。优点：（1）对温度的要求低，操作工艺简单（2）染菌机率较低，比较容易解决染菌和衰退问题（3）不会产生菌种老化和变异等问题，对营养物利用率较高，产物浓度较连续发酵高缺点：（1）人力、物力、动力消耗较大（2）生产周期长（3）生产效率低培养基的制备与灭菌1.生产上用的菌种培养和发酵培养基有何要求（1）单位培养基能生产最大量的目的产物，且使目的产物的合成速率最大（2）发酵副产物尽可能少（3）原料应因地制宜，价格低廉，且性能稳定，资源丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产的供应（4）能满足总体工艺的要求，如不应影响通气、提取、纯化及废物处理等。2.各种成分的功能（1）碳源：用于供给菌种生命活动所需的能量，和构成菌体细胞以及代谢产物的物质基础。（2）氮源：用于构成菌体细胞物质和代谢产物，即蛋白质及氨基酸之类的含氮代谢物。（3）无机盐：构成菌体的成分，作为酶的组成部分或维持酶的活性，调节渗透压、pH值、氧化还原电位等，是微生物生命活动不可缺少的物质。（4）特殊生长因子：构成辅酶的组成部分，促进生命活动进行。（5）水：是微生物生长所必需的，微生物所需要的营养物质及代谢产物必须溶解于水中，才能通过细胞膜而被吸收或排出；体内各种生化反应必须在水溶液中才能进行。3.淀粉水解糖的制备方法有哪几种，特点如何（1）酸解法：以酸为催化剂，在高温高压下将淀粉水解为葡萄糖。特点是a.生产方法简单b.对设备要求简单c.水解时间短d.设备生产能力大e.要求耐腐蚀、耐高温高压的设备f.对淀粉原料要求严格g.存在副反应（2）酶解法：用淀粉酶将淀粉水解为葡萄糖。特点是a.糖化程度高，糖液杂质少，水解液葡萄糖纯度高b.反应条件温和，不需要耐腐蚀、耐高温高压的设备c.酶作用专一性强，淀粉水解副反应少d.可在较高淀粉浓度下水解e.可简化发酵培养基的组成f.产物糖液颜色浅，较纯净，无苦味，质量高，利于精制g.反应时间较长h.要求设备较多，需具备专门培养酶的条件，且糖液过滤困难（3）酸酶结合水解法：根据原料淀粉性质分为酸酶法和酶酸法。酸酶法：先将淀粉酸水解成糊精或低聚糖，再用糖化酶水解为葡萄糖。特点是a.酸液化速度快b.糖化由酶进行，对液化液要求不高，可采用较高的淀粉乳浓度c.用酸量较少，产品颜色浅，糖液质量高酶酸法：将淀粉乳先用α—淀粉酶液化到一定程度，再用酸水解成葡萄糖。特点是a.水解较酸法均匀，出糖高，可采用粗原料淀粉及高浓度淀粉b.副反应较少，糖液色泽较浅。4.糖蜜原料的特点和用于发酵时要注意哪些问题糖蜜是甘蔗或甜菜糖厂的一种副产物，又称桔水；特点是干物质浓度大，含糖量高，本身含相当数量的发酵性糖，无须糖化，胶体物质与灰分多，产酸细菌多。用于发酵时应注意：由于糖蜜中干物质的浓度很大，为80~90°Bx，含糖分50%以上，含5%~12%的胶体物质以及10%~12%的灰分，如果不进行预处理则微生物无法生长和发酵，故糖蜜的发酵前处理很重要。酒精发酵糖蜜前处理的方法：（1）加酸通风沉淀法（冷酸通沉淀风法）（2）加热加酸沉淀法（热酸通风沉淀法）（3）添加絮凝剂澄清处理法。谷氨酸发酵糖蜜前处理：（1）一般处理法：①活性炭处理法②树脂处理法③亚硝酸处理法（2）添加化学药剂处理法：①添加青霉素法②添加表面活性剂③添加抗氧剂法（3）追加糖蜜法（先用处理的糖蜜培养菌种后再流加不处理的糖蜜）（4）营养缺陷型变异株法（选育油酸缺陷型变异株）。5.培养基的灭菌温度和压力控制、灭菌时间长短如何控制。（对数残留定律、高温瞬时灭菌）湿热灭菌：121℃，30min。干热灭菌：温度（℃）170160150140121灭菌时间（min）60120150180过夜上述为灭菌时间与温度的经验性选择，若题干问的是计算选择，请参与课本P44-46例题，为温度和时间的计算题。6.灭菌方法的选择、特点干热灭菌：加热到一定温度将微生物杀死，基本原理有氧化,蛋白质变性和电解质浓缩引起的中毒等，用于灭菌后需要干燥的物料和器皿。湿热灭菌：依靠蒸汽热和压力破坏蛋白质,酶和核酸分子内化学键(氢键),使发生不可逆转的变性而使微生物死亡,实验窒和工业生产中最常用。但不能用于怕受潮的物料灭菌。射线灭菌：通常用紫外线、高速电子流的阴极射线、X射线和γ射线等进行灭菌，以紫外线最常用。主要用于空间灭菌,如超净工作台,无菌室,GMP药品生产车间等。化学药品灭菌法：采用浸泡、添加、擦拭、喷洒、气熏等方式。如0.1%~0.25%的高锰酸钾、漂白粉(次氯酸钠)、75%的酒精、新洁尔灭、甲醛、戊二醛、过氧乙酸等。由于它会与被灭物质产生反应，所以不能用于培养基的灭菌。糖嫌气性发酵产物积累机制1.如何才能有效地进行代谢调控发酵代谢控制发酵——是人为地改变微生物的代谢调控机制，使有用的中间代谢产物过量积累。A、酶合成的调节：（1）酶的诱导负向控制（如乳糖对β-半乳糖苷酶）与正向控制。（2）终产物阻遏作用和弱化调节。（3）分解代谢物阻遏（如葡萄糖对β-半乳糖苷酶的阻遏）。（4）转录后的调节。B、酶活性的调节：酶活性的调节是指一定数量的酶,通过其分子结构的改变来调节其催化反应的速率。（1）底物和产物的性质和浓度（2）环境因子（如浓度、压力、pH、离子强度和辅助因子等）以及其它酶的存在都有可能激活或抑制酶的活性。C、能荷的调节：能荷是一个表示细胞能量状态的参数。是细胞中所含腺苷酸中含有相当于ATP的数量百分比，其表示式为：能荷（EC）=（[ATP]+0.5[ADP]）/（[ATP]+[ADP]+[AMP]）×100%。能量不仅调节生成ATP的分解代谢酶类的活性，也能调节利用ATP的生物合成酶类的活性。糖代谢和中心代谢途径中的酶活性受能荷的调节。当能荷降低时，激活催化糖分解；当能荷生高时，抑制糖的分解，加速糖原的合成。D细胞膜透性的调节：由于微生物具有高度严密的自我调节能力，中间代谢产物不会大量积累而排除体外。发酵工程的任务之一是人为地改变微生物代谢调控机制，其中包括改变代谢物的膜透性，使目的产物及时地分泌出体外，避免在体内积累而引起反馈抑制。（1）控制脂肪酸的合成（2）控制磷酸的合成（3）利用抗生素作用来改变细胞壁结构提高细胞膜通透性2.耗氧发酵和厌氧发酵主要区别，产物形成类型主要区别是厌氧发酵过程中，不需要供给无菌空气；此外，在好氧发酵条件过程中，丙酮酸进入TCA环进行代谢，产生各种氧化代谢产物或完全氧化获得能量。厌氧：（1）乙醇生成机制主产物：在酵母体内，葡萄糖经酵解途径，生成丙酮酸，在无氧条件下，在丙酮酸脱羧酶催化作用下，丙酮酸生成乙醛。丙酮酸丙酮酸脱羧酶乙醛+CO2副产物：杂醇油、琥珀酸、酯类、糠醛、甲醇、甘油（2）乳酸发酵机制：分为同型乳酸发酵、异型乳酸发酵（6－磷酸葡萄糖酸途径、双歧途径）耗氧：包括有机酸、氨基酸、核苷酸和抗生素的发酵。3.柠檬酸生物合成调控要点（有哪些酶参与控制）（1）磷酸果糖激酶(PFK)是调节酶，受ATP和柠檬酸的抑制,而被AMP,无机磷和NH4+激活.这表明了NH4+能有效解除柠檬酸对PFK的抑制，而大量积累柠檬酸.（2）柠檬酸合成酶,受ATP抑制,而在菌种细胞中，ATP主要以络合物ATP-Mg的形式存在,其抑制作用较弱.而草酰乙酸可激活此酶(通过提高此酶与乙酰CoA的亲和力实现).（3）丙酮酸羧化酶，也称线粒体酶，是组成酶，有四个亚基与四分子生物素连接。①生物素辅基在酶的位点上起中间载体的作用将羧基转移到丙酮酸上生成草酰乙酸。②K+对该酶有激活作用（4）丙酮酸脱H酶①受ATP和亚砷酸的抑制。②ADP、Ca+使该酶激活。4.采用黑曲酶生长柠檬酸时，哪些条件要注意控制？为什么？（1）锰缺乏(30mmol)→抑制蛋白质合成→NH4+浓度上升(25mmol左右)解除柠檬酸对磷酸果糖激酶的抑制.（2）不产ATP的侧系呼吸链→解除对磷酸果糖激酶的抑制→EMP途径顺畅（3）应降低Fe2+浓度来抑制顺乌头酸水合酶的话性.（4）降低pH值有利于积累柠檬酸.5.谷氨酸（GA）合成受TCA，DCA二环控制要点a-酮戊二酸脱氢酶在谷氨酸生物合成中时非常重要的。该酶的活力很弱，使糖代谢流进入TCA循环后受阻在a-酮戊二酸处，在有NH+存在下，由谷氨酸脱氢酶催化还原氨基化生成谷氨酸。DCA:DCA循环在TCA有缺陷是可以补充C4二羧酸，特别是醋酸和乙醇发酵为原料的谷氨酸发酵，它是C4的唯一补充来源。但又DCA循环发酵GA，糖的转化率大大降低，因此，在谷氨酸生成期间DCA循环应关闭。有机酸浓度低时，DCA运转，异柠檬酸裂解酶催化生成的乙醛酸与细胞内的草酰乙酸共同抑制异柠檬酸脱氢酶。另一方面，DCA运转，TCA循环的有机酸过剩，异柠檬酸裂解酶被抑制，乙醛酸浓度下降，解除对异柠檬酸脱氢酶的抑制，TCA运转。这样，有机酸浓度高时，DCA循环停止运转，TCA循环进行。6.谷氨酸发生发酵转换的条件是什么在谷氨酸发酵时，当发酵条件，环境因素变化时，导致其它产物过多合成的现象就是谷氨酸的发酵转换。常见的有：溶解氧通气不足时，合成乳酸或琥珀酸；过量时，合成α—酮戊二酸。NH4+不足时，合成α—酮戊二酸；过量时合成谷氨酰胺。磷酸浓度过高时，合成缬氨酸。此外，生物素、氧化还原电位等因素也可能影响谷氨酸发生发酵转换。7.谷氨酸发酵菌体细胞膜通透性与哪些酶有关，如何控制a)生物素贫乏的培养基中积累大量的谷氨酸；生物素丰富的培养基中几乎不积累谷氨酸b)生物素贫乏的细胞内谷氨酸含量少，而且容易被洗出；生物素丰富的细胞内含有大量的谷氨酸，而且不容易被洗出，只有用表面活性剂处理才能洗出。谷氨酸的分泌受细胞膜控制，而影响细胞膜的谷氨酸通透性主要是细胞膜的磷脂含量。提高细胞膜的谷氨酸通透性，必须从控制磷脂的合成着手或者使细胞膜受损伤。生物素是脂肪酸生物合成中CoA羧化酶的辅酶，该酶催化乙酰CoA合成丙二酰CoA。生物素促进脂肪酸合成