生物分离工程-第二章-细胞破碎

生物工程下游技术第二章细胞分离与破碎3学时学习目的和要求掌握解细胞分离和目标产物的释放的原理和方法，熟知各种方法的优缺点和应用范围。目录一、细胞分离（一）、重力沉降（二）、离心沉降（三）、过滤二、细胞破碎与胞内物释放细胞分离－学习要点识记：重力沉降、离心沉降和过滤的概念。理解：重力沉降、离心分离与过滤原理、理论；掌握Stokes（斯托克斯）沉降公式。应用：常用离心方法及优缺点；利用掌握的提高分离效率的方法分析决实际问题（一）、重力沉淀1、重力沉淀的定义2、重力沉淀的理论3、提高重力沉降的途径1、重力沉降定义重力沉降是传统化工过程中常用的从含有固体颗粒的流体中将颗粒分离出来的操作。重力沉降是利用流体与颗粒间的密度差，在重力的作用下使颗粒与流体之间产生相对运动，从而实现两者的分离。在生物分离过程中，定义中颗粒为细胞、细胞碎片等有形物千姿百态的微生物世界BacterialmorphologydiagramHigh-densitycellculture2、重力沉降理论理论假设细胞或细胞碎片按照球形颗粒处理；颗粒在无限稀释的溶液中进行沉降，颗粒之间无相互干扰受力分析球形颗粒重力fg液体的浮力fb颗粒运动方向相反的阻力fsFs球形颗粒沉降的受力情况重力沉降理论gdfspg361gdfLpb3614222pgLSdvf重力：浮力：阻力：sd,Ps—分别指颗粒的直径（m）和密度（kg.m-3）SedimentationFigure3.1Schematicrepresentationofseparationofsolidsbysetting重力沉降理论当球形颗粒自身的重力与其所受到浮力和阻力达到平衡时，bSgfffgdvpLLSg342则重力沉降理论1Re103当球形颗粒处于滞流区（）时Re24gdvLLSpg182Stokes公式当球形颗粒处于过渡区（）时310Re15.0Re105.06.0Re27.0LLSpggdvAllen公式当球形颗粒处于湍流区（）时53102Re1044.05.074.1LLSpggdvNewton公式千姿百态的微生物世界BacterialmorphologydiagramHigh-densitycellculture球形颗粒？无限稀释溶液？3、提高重力沉降的途径加入中性盐：双电层排斥电位降低加入高分子絮凝剂：架桥作用形成大絮凝图引入外力PSAA)(F（二）、离心沉淀1、离心沉淀的定义2、离心沉淀的理论3、离心分离方法4、离心分离设备1、离心沉降定义离心沉降是利用沉降设备使流体和颗粒旋转，在离心力的作用下，由于颗粒和流体间存在密度差，所以颗粒沿径向与流体产生相对运动，从而使颗粒和流体分离。SuprenatantWetSolidsFigure3.2Schematicrepresentationofcentrifugalseparationcentrifugation2、离心沉降理论rdvLLSPS2218)(离心沉降速度令：LLSPdS18)(2rSvS2gdvLLSpg1823、离心分离方法差速离心分级区带离心差速区带离心平衡区带离心差速离心分离差速离心是以菌体细胞的收集或除去为目的的固液离心分离方法，应用某一特定颗粒沉淀的离心力在预定的离心时间内得到一部分颗粒沉淀及包含未沉淀颗粒的上清液。差速离心分离应用实例600g10min15000g10min100000g60min300000g120minnucleiMitochondrialysosomesPlasmamembraneRiosomalsubunitshomogenateFilteredhomogenateSolublepartofcytoplasmSedimentation区带离心分离－前提在离心管内的溶液存在密度梯度。采用事先配好的不同浓度（密度）的梯度介质（蔗糖等），按照浓度从大到小的原则，依次层层加入。加入离心管中的梯度介质经高速离心或静置后可形成连续的密度梯度。操作过程区带离心种类差速区带离心(速度区带离心）平衡区带离心（等密度离心）差速区带离心差速区带离心基于颗粒的大小、形状的分离梯度液的最大密度不能超过所分离颗粒的最大密度离心过程中，颗粒不断沉降至其浮力密度与梯度液密度相等动态离心分离方法平衡区带离心平衡区带离心梯度液密度范围含盖全部待分离颗粒密度离心过程中，颗粒不断沉降至其浮力密度与梯度液密度相等平衡离心分离方法梯度液的种类和应用细胞分离－区带离心异同区带离心种类差速区带离心平衡区带离心共同点事先在离心管内用低分子量溶质调配好密度梯度梯度介质常用蔗糖常用氯化铯密度梯度最大的密度梯度低于最大密度的沉降样品最大的密度梯度大于最大密度的沉降样品区带形成条件根据各个组分沉降系数的差别，形成各自的区带根据各组分密度差形成区带离心条件在最前的沉降物质达到管底前停止，短时间，低速度使各组分沉降到其平衡的密度区，长时间，高速度离心方法新进展具体表现在哪几个方面？1.固定角转子垂直管离心法的进展使用垂直管转子的成功之例是1980年由B.H.Chung等提高的血清脂蛋r白分离的SVs方法(即SingleVerticalSpin法,一单次垂直管离心法)，它使对临床诊断意义很大的这一分离在实用上成为可能.传统的血清脂蛋白分离用“顺序浮选法”(即SF法)，一次分离需时3天，用去驱动寿命1亿转以上。现用垂直管转子作SVS方法，不连续NaCI/KBr或NaCI/Sucrose梯度，5.5万一6.5万转/分，0.75-2.5i)时，一次分离成功。3.短液柱离心法(Short-Columnmethod)由美国的0.M.Griffith在1978年提出。短柱法是在角式或水平转子中人为地使用不加满的离心管来降低液柱高。此法不仅降低液柱高以减少离心时间，更重要的是使处千液面的样品受到更大的离心力从而进一步缩短了离心时间，在不减少样品量和样品浓度的条件下，可把离心时间缩短为常规满管离心时的一半或更少。短液柱法使用中厚PC管和厚壁PA管，它们在不加满离心时也不会变形。4.细绝(或细菌)的离心洗脱(Flutriator)技术这是美国Beckman公司近年发展的一种低速连续洗脱技术，特别适用于培养液的连续收集。使用的是带小容量连续离心池的JE-6B转子.其洗脱原理不是在一般转子中的沉降，而是被分离物在离心中的“浮选”。用4.2ml的离心池可在1小时内从100-1000m!的原液中回收10'-10，个细胞。2.超速连续离心法超速连续离心转子是由美国Beckman公司开发的，最适用于病毒的纯化，从大量的组织匀浆中分离亚细胞组织、培养液中细菌的收集，以及污水研究。4、离心设备分类分类方法名称处理量实验室用离心机，工业用离心机温度常温离心机、冷冻离心机转速低速离心机、高速离心机、超速离心机转子结构管式、碟式常用离心设备Solids-ejectingdiskbowlcentrifugeofpilotsizeforsterilizablecontainedinstallationNozzlemachinewithpressurizedsolidsdischargeforyeastandbacteriaseparation常用离心设备DecantercentrifugeMultichamberbowl,verticalcut管式离心设备AdisposablecellseparationinsertPowerfugeTMone-chamberwithscraperTubularbowl碟片离心设备(a)Solids-retainingdiskbowl,(b)Radialsolids-ejectingdiskbowl,topfeed.(c)Radialsolids-ejectingdiskbowl,hermeticfeed.(d)Axialsolids-ejectingdiskbowl.(e)Nozzlebowlwithpressurizedsolidsdischarge.(f)Nozzlebowlwithperipheraldischargenozzles.离心设备比较管式离心机优点结构简单，转速和离心力较大缺点沉降面积小、处理能力低；碟式离心机优点转子中存在隔板以增大沉降面积，处理能力大缺点结构复杂、转速较低；离心机处理能力粒子在径向上的沉降速度grvdtdrvgs2轴向移动速度2122rrQdtdzuz完全沉降的边界条件0z1rrLz2rr1222122lnrrgrrLvQg离心机处理能力影响因素处理样品的特性，如密度、粒径等溶液的特性，如密度、粘度等离心机机械结构，如r1和r2操作条件，ω（三）、过滤1、过滤的定义2、过滤的受力分析3、提高过滤速度的途径1、过滤定义过滤是利用多孔性介质（如滤布）截留固液悬浮液中的固体粒子，进行固液分离的方法。过滤本身是一种膜分离技术。在分离细胞、菌体或它们的碎片过程中除了沉降分离方法外，过滤技术也是一种常备的分离方法。2、过滤过程受力分析推动力：过滤操作以压力差为主要推动力；阻力：过滤过程的阻力来自多孔性过滤介质和介质表面不断堆积形成的滤饼过滤速率cmLRRpAdtdQQ：液体的流量A:面积Rm表示介质的阻力；Rc表示滤饼的阻力；μL为滤液的粘度恒压过滤方程Ruth恒压过滤方程020ttKQQ其中，K为Ruth恒压过滤系数，表示为SLLSccpAK1223、提高过滤速度的途径采用絮凝或凝聚的方法预处理改变料液的性质，降低滤饼阻力加入助滤剂以改变滤饼的压缩性指数，提高过滤速度滤饼传统的过滤cakeConventionalfiltrationfilterfilterfilterfiltratesolidsrecoveryuponbackflushFigure2.1SchematicrespresentationodsfilterpressConceptualrepresentationofplateandframefilterFlowsheetforcontinuousrotaryvacuumfiltrationwashspraysAirconnectioncakeContinuosrotaryfilterWashwaterpumpWashFiltratepumpMoisturetrap30'AiroutDryvacuumpumpBarometricsealVacuumreceiversFigure2.2Flowsheetforcontinuousrotaryvacuumfiltration二、细胞破碎与胞内物释放1、概述2、细胞破碎技术的分类3、常用破碎方法的介绍－学习要点理解：各种细胞破碎方法原理、优缺点及其适用范围。应用：采用不同的细胞破碎方法对不同细胞进行不同程度的破碎。1、概述（1）细胞结构（2）细胞膜的组成（3）影响产物释放的因素（1）细胞结构（真核细胞与原核细胞）动物细胞没有细胞壁，只有由脂质和蛋白质组成的细胞膜植物细胞细胞膜外有一层坚固的细胞壁酵母细胞细胞壁由葡聚糖、甘露聚糖和蛋白质构成，更加难以破碎真核细胞原核细胞革兰氏阳性菌细胞壁由肽聚糖层组成，壁厚约15～50nm，肽聚糖含量为40~90%，细胞壁较革兰氏阴性菌坚固。革兰氏阴性菌细胞壁在肽聚糖的外侧还有分别由（1）脂蛋白和（2）磷脂和脂多糖构成的两层外壁层，外壁层厚度越8～10nm。（2）细胞膜组成（A）（B）（3）影响产物释放的环境因素在复杂培养基中生长的大肠杆菌细胞其破碎较单一培养基中生长的大肠杆菌细胞更难；对数生长期的细胞会表现得更加脆弱。从连续培养过程中获得的、具有较高比生长速率的念珠菌的细胞壁