生物分离工程-第七章-色谱技术

生物工程下游技术第七章色谱技术目的和要求了解色谱原理，掌握各种常用色谱方法的操作与应用。目录色谱原理与分类色谱过程理论模型分离度凝胶过滤色谱离子交换色谱疏水性相互作用色谱流通色谱本章主要知识点什么是色谱分离技术？色谱分离技术的分类什么是色谱柱的理论塔板数以及如何计算？吸附色谱及其分类和基本原理什么是分配色谱？离子交换色谱的分类及应用凝胶色谱的分离原理及分类离子交换及疏水作用层析的原理高效液相色谱的分离原理及应用蛋白质分离的常用色谱方法有哪些？色谱技术（分配色谱）概念：色谱技术是一组相关分离方法的总称，色谱柱的一般结构含有固定相（多孔介质）和流动相，根据物质在两相间的分配行为不同（由于亲和力差异），经过多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸…），达到分离的目的。一、色谱原理与分类－学习要点识记：色谱方法分类理解：色谱原理1、定义（chromatograph）定义色谱是根据混合物中溶质在互不混溶的两相间分配行为的差别而引起移动速度的不同而进行分离的方法。2、原理色谱操作中互不混溶的两相分别称为固定相和流动相。固定相填充于柱内形成固定床，在柱的入口端加入料液后，连续输入流动相，料液中溶质在流动相与固定相之间扩散传质，产生分配平衡在色谱过程中，分配系数大的溶质在固定相上存在的概率大，随流动相移动速度小。由此，溶质之间由于移动速度的不同而得到分离。3、色谱分离方法的分类色谱分离方法很多，种类有四、五十种，但常用于生物大分子分离的色谱方法，按机理分以下几种：吸附色谱分配色谱离子交换色谱凝胶色谱色谱系统的基本组成（1）流动相分类气相色谱液相色谱超临界色谱（2）固相分类类型分配色谱（固定相为液相）吸附色谱（固定相为固相）形状纸色谱薄层色谱柱色谱纸层析薄层层析（3）操作压力分类低压液相色谱（0.5MPa）中压液相色谱（0.5-4.0MPa）高压液相色谱（4.0MPa）（4）流动相流动方式分类轴向流色谱径向流色谱（5）分离操作方式分类洗脱色谱迎头色谱顶替展开（6）机理分类凝胶过滤色谱离子交换色谱反相色谱疏水性相互作用色谱亲和色谱4、色谱分离原理分配系数可由Langmuir方程得出Kd---分配系数q、c---溶质在固相和液相中的浓度cqKd保留时间（tR）和保留体积（VR）反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱过程的基本热力学参数之一阻滞因子Rt阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物（与固定相没有亲和力的流动相Kd=0）的迁移率之比其意义在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小迁移距离流动相在色谱系统中的溶质的迁移距离fRsdmmfAKAAR洗脱体积色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体积，为洗脱体积不同的溶质，由于和固定相的亲和力的不同，洗脱体积也有所差异sdmeVKVV塔板理论马丁（Martin）和欣革（Synge）最早提出塔板理论，将色谱柱比作蒸馏塔，把一根连续的色谱柱设想成由许多小段组成。在每一小段内，一部分空间为固定相占据，另一部分空间充满流动相。组分随流动相进入色谱柱后，就在两相间进行分配。并假定在每一小段内组分可以很快地在两相中达到分配平衡，这样一个小段称作一个理论塔板（theoreticalplate），一个理论塔板的长度称为理论塔板高度（theoreticalplateheight）H。经过多次分配平衡，分配系数小的组分，先离开蒸馏塔，分配系数大的组分后离开蒸馏塔。由于色谱柱内的塔板数相当多，因此即使组分分配系数只有微小差异，仍然可以获得好的分离效果。色谱柱的理论塔板数、塔板高度反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系理论塔板数的计算方法：N---理论塔板数tR---保留时间W1/2---半峰宽Wb---峰底宽度理论塔板高度：L---柱长22/1)(54.5WtNR2)(16bRWtNNLH5、分离度识记：分离度的概念理解：如何分离度判断两个相邻洗脱峰的分离程度（1）定义及表述定义分离度又称分辨率，是表达两种洗脱曲线相邻的溶质相互分离的程度分离度的表达Gauss洗脱曲线的分离度21122WWRRRS122112422SmmNRmFmF（2）分离度的其它表征方法容量因子容量因子是固定相与流动相间溶质分配量之比，用k’表示选择性选择性为洗脱峰相邻的两种溶质的容量因子之比'2'2114121kkNRS12122''41'SkkRNk6、凝胶过滤色谱－学习要点理解：凝胶过滤的原理和操作，凝胶过滤介质的要求和影响分离特性的因素应用：掌握凝胶色谱的应用及特点（1）定义凝胶过滤色谱利用凝胶粒子为固定相，是根据料液中溶质相对分子量的差别进行分离的液相色谱法（2）原理在GFC柱中，分子量大的溶质不能进入凝胶介质，而沿介质空隙流过分子量很小的溶质能够进入所有的细孔中，其洗脱体积接近柱体积分子两介于两者之间的溶质能够进入部分细孔中（3）分配系数凝胶过滤色谱的分配系数可用下式表示GFC的分配系数在0～1之间，分离精度有限。00tVmVVVSmallestsolute:(acetone)Fullaccesstothepores,Vt;Largestsolute:(BlueDx2000)Excludedfromthepores,V0（4）影响分配系数因素相对分子量相对分子量一定的溶质的m值为常数，为凝胶介质对该溶质的有效孔隙率εp；分配系数随相对分子量的增加而降低；分子形状凝胶结构（5）介质应满足条件亲水性高，表面惰性稳定性好，在较宽的pH和离子强度范围及化学试剂中保持稳定，使用寿命长；具有一定的孔径分布范围；机械强度高，允许较高的操作压力；（6）常用的GFC介质葡聚糖凝胶介质葡聚糖（右旋糖酐）与环氧氯丙烷合成琼脂糖凝胶介质琼脂糖与环氧氯丙烷合成其他亲水性高分子合成的凝胶介质多种多糖制备的凝胶介质SephadexGSepharoseCL/FFTSKSuperose（7）凝胶特性参数排阻极限不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量分级范围能为凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质的相对分子量范围溶胀率介质溶胀后每千克干凝胶所吸收的水分的百分数其他参数凝胶粒径、床体积、空隙体积（8）影响操作的因素线速度料液体积料液浓度分子量与分配系数关系凝胶粒径（9）应用分离纯化脱盐相对分子量测定（10）特点溶质与介质不发生任何形式的相互作用，因此可采用恒定洗脱法洗脱展开，操作条件温和，产品收率接近100%；分离结束后无需苛刻的介质清洗或再生，循环操作易实现，提高了产品纯度；作为脱盐手段，GFC比透析法速度快、精度高；与超滤法相比，剪切应力小，蛋白活性收率高；分离机理简单，操作参数小，规模放大容易；（11）不足仅根据溶质间相对分子质量的差异进行分离，选择性低，料液处理量小，一般为柱体积的5%；经GFC洗脱展开后产品被稀释，因此需要在其它浓缩作用的单元操作后使用；7、离子交换色谱－学习要点理解：离子交换色谱的原理和操作，线性剃度洗脱过程和逐次洗脱过程应用：掌握离子交换色谱的应用特点（1）概念离子交换色谱利用离子交换剂为固定相，是根据荷电溶质与离子交换剂之间的静电相互作用力的差别进行溶质分离的洗脱色谱法（2）分配系数溶质在离子交换剂上的分配系数可表示为其中m∞为离子强度无限大时溶质的分配系数分配系数对I很敏感，I微小的变化都会引起分配系数的改变；不同蛋白质B值相差很大mIAImB主要阴离子交换配基二乙胺乙基，Diethylaminoethyl(DEAE)Quaternaryaminoethyl(QAE)季胺乙基，Quaternaryammonium(Q)主要阳离子交换配基羧甲基，Carboxymethyl(CM)磺丙基，Sulphopropyl(SP)Methylsulphonate(S)（3）线性洗脱法线形洗脱法（lineargradientelution)流动相的离子强度线性增大，因此溶质的分配系数连续降低，移动速度逐渐增大特点难于洗脱的溶质在较小流动相体积下洗脱；改变流动相离子强度增大速度可调节溶质的洗脱体积；流动相离子强度（盐浓度）连续增大，不出现干扰峰，操作范围广；需要特殊调配浓度梯度的设备（4）阶跃梯度洗脱法阶跃梯度洗脱法（Stepwiseelution）流动相的离子强度阶跃增大，溶质的分配系数的降低和移动速度的增大也是阶段式的。特点当阶跃速度很快，则其接近线性梯度洗脱；反之，则接近恒定洗脱；利用切换不同盐浓度的流动相进行洗脱，不需要特殊梯度设备，操作简便；流动相浓度不连续变化，易出干扰峰；易出现多组分洗脱峰重叠现象；（5）洗脱时间线性梯度洗脱过程中溶质的迁移速度vp为1ppdzuvdtmHIm(I)不再为常数，而是I的函数由于与生物大分子相比，IEC柱内盐离子在固定相粒子内传质非常快，盐离子在两相间的平衡瞬间完成，则mcHfudtdzv'1sIImI对盐离子而言，可有如下的方程：22SzIIIIIDuFtzzt对线性梯度而言Iz常数220Iz洗脱时间通过测定不同流动相离子强度梯度下溶质洗脱位置离子强度Ip值，可获得Ip与GH之间的关系曲线0GHpIIIpfdImImI0GHtIVVV其中01pIRIILFmtIVFu洗脱时间为：（P275图7-21）（6）IEC柱内溶质迁移在线性梯度洗脱条件下，IEC柱内溶质区带的后部移动速度高于前部，即线性梯度洗脱具有区带浓缩作用；由于轴向返混和传质阻力的影响，溶质区带在洗脱过程中不断分散；洗脱操作前期，返混等占主导地位，区带宽度不断增加；随着区带宽度的增加，区带前后溶质运动速度差增大，即浓缩作用增大当区带宽度增至一定值后，浓缩与分散作用达到平衡，区带将以一定的宽度向下移动（7）分离度当离子强度梯度一定时，分离度与柱高无关当柱高一定时，分离度随离子强度梯度的降低而增大分离度与成反比12213122101118HETPppISIILFFmJRFmIVIV11221011HETPHETPCSRIVIVLVA12pdu（8）特点料液处理量大，具有浓缩作用；应用范围广泛，通过优化条件可大幅度提高分离的选择性，所需柱长短；吸附作用机理明确，非特异性吸附小，产品回收率高；离子交换剂种类多，选择余地大，价格远低于亲和吸附剂；影响分离特性因素复杂；8、疏水性相互作用色谱学习要点理解：原理，影响疏水性吸附的因素应用：掌握疏水性相互作用色谱方法对蛋白质分离（1）定义疏水性相互作用色谱利用表面偶联弱疏水性基团（疏水性配基）的疏水性吸附剂为固定相，根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质类生物大分子分离纯化的洗脱色谱法。（2）原理组成蛋白质的氨基酸中包括一些疏水性氨基酸基团，如苯丙氨酸，酪氨酸；这些基团大部分处于蛋白质内部，但有部分疏水基团暴露于蛋白质表面；在高离子强度盐溶液中，蛋白质表面的水化层被破坏，更多的疏水部分暴露在外这些暴露在外的疏水基团与介质上的弱疏水性配基发生疏水性作用，被固定相吸附蛋白质在疏水性吸附剂上的分配系数随流动相盐析盐浓度的提高而增大HIC采用高盐下吸附，低盐下洗脱原理图示（3）疏水性吸附剂常用配基苯基、短链烷基、烷氨基、聚乙二醇聚醚修饰密度疏水配基修饰密度一般在10~40umol/ml疏水性吸附作用与配基的疏水性和配基目的成正比，故配基的修饰密度应根据配基的疏水性而异。（4）影响疏水性吸附的因素－离子强度、种类和破坏水化作用的物质离子强度及种类蛋白质的疏水性吸附作用随离子强度提