生物化学实验方法及常用仪器介绍

生物化学实验方法及常用仪器介绍授课：王琼联系方式：2186772（O）；15959252020E-mail：[e-mail]原料液、动植物器官、组织路线二细胞-胞内产物碎片分离路线一清液-胞外产物细胞分离（离心、过滤）细胞破碎精制（结晶、干燥）粗分离（盐析、萃取、超过滤）纯化（层析、电泳）脱盐（凝胶过滤、超过滤）浓缩（超过滤）分离纯化一般过程一、离心技术离心（centrifuge）•离心是利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数或浮力密度的差异进行分离、浓缩和提纯的一种方法。•离心技术是利用离心力对混合液（含有固形物）进行分离和沉淀的一种技术。离心技术简介离心分离是制备生物样品广泛应用的重要手段，可以分离：•活体生物（细胞、微生物、病毒）•细胞器（细胞核、细胞膜、线粒体）•生物大分子（核酸、蛋白质、酶、多聚物）•小分子聚合物离心技术简介离心技术的发展•1911-1912年，开始生产和使用低速（3,000rpm以下）的商品化台式离心机•1923-1926年，瑞典UPPSALA大学Svedberg等科学家试制了世界上第一台试验型超速离心机（45,000rpm）。1926年测定了马血红蛋白的分子量，获得诺贝尔化学奖。•1929年，Lamm完成了沉降方程。计算了沉降速度。定义了沉降系数•1940年，Svedberg与Pederson出版了世界上第一本有关离心技术的专著•1943年，Pickels研制成现代固定角式离心转子离心技术的发展离心技术的发展•1951年，Brakke在差速离心的基础上发展了速率区带离心法。Kahler研制成功甩平转子；•1955年，Anderson发明了区带转头，并用区带离心法首次证明了DNA双螺旋结构半保留复制的假说；•1955年以后，开始了超速、高速、低速大容量离心机以及分析用超速离心机的商品化生产•1957-1959年，Meselson、Duve等开发了等密度离心法。•1964－1966年，Anderson等开始建立转子区带离心技术并开发了低、高、超速区带转头。•1975年，垂直管转子被开发并用于Dupont-Sorvall油透平驱动的超速离心机。•1981年，美国Beckman公司开发的用于细胞离心纯化的“淘洗”转头供应市场。•……离心技术的发展1.离心力Centrifugalforce(F)F=mω2r其中：m—沉降粒子的有效质量；ω—粒子旋转的角速度；r—粒子的旋转半径(cm)ω=——(rad/sec)离心技术原理2πN602.相对离心力Relativecentrifugalforce(RCF)RCF就是实际离心力转化为重力加速度的倍数RCF=F离心力/F重=mω2r/mg=ω2r/gω=——(rad/sec)RCF=42n2r/3600g=1.12×10-5n2r其中：n－每分钟的转数(rpm)离心技术原理从外界因素看，颗粒的沉降速度取决于离心机的转速及其自身与中心轴的距离。2πn60•只要给出旋转半径r，则RCF和rpm之间可以相互换算。•由于转头的形状及结构的差异，使每台离心机的离心管，从管口至管底的各点与旋转轴之间的距离是不一样的，所以在计算时规定旋转半径均用平均半径“rav”代替：rav=(rmin+rmax)/2离心技术原理3.沉降速度（Sedimentationvelocity）指在强大离心作用下，单位时间内物质运动的距离。=d2(-)g/18Stokes方程其中：－颗粒的沉降速度d－颗粒直径－颗粒密度－介质密度－介质的粘度离心技术原理1、颗粒沉降速度与颗粒直径平方成正比，颗粒大沉降快2、颗粒沉降速度与颗粒和介质密度差成正比，密度之差越大沉降越快4.沉降系数（sedimentationcoefficient，S）颗粒在单位离心力作用下的沉降速度称为该颗粒的沉降系数，把10-13秒作为一个单位，称为斯维得贝格单位，或称沉降系数单位，用S表示。离心技术原理S＝＝(-)d2182r式中：S—沉降系数－沉降速度r－旋转半径－介质粘度d－颗粒直径－样品中颗粒的密度－溶剂的密度例如：溶菌酶的沉降系数为2.15×10-13s，通常叫做2.15S；过氧化氢酶的沉降系数为11.35×10-13s，就称11.35S；大肠杆菌核蛋白体是70S，由两个亚基组成，用超离心方法测其沉降系数分别为30S和50S。离心技术原理蛋白质的沉降系数一般在1-200S之间。离心技术原理某些生物样品的沉降系数、相对离心力和转速的范围样品沉降系数/SRCF/g转速n/rpm细胞1072001500细胞核4×106-1×107600-8003000线粒体（2-7）×10470007000微粒体50-10410万30000DNA10-12010万30000RNA4-5040万60000蛋白质2-2540万60000离心机结构离心机分类低速离心机最大转速:4000～7000rpm最大离心力:2220～9420g高速离心机最大转速:15000～26000rpm最大离心力:16100～801100g超速离心机最大转速:55000～150000rpm最大离心力:363600～9011000g分离物大小：1～50μmMicrobialcell，hemocyte，cell分离物大小：0.1～1μmMitochondria，Lysosome，cellWell分离物大小：0.002～0.1μmDNA，RNA，Virus，Protein，Enzyme根据转速根据用途制备型离心机分析型离心机分离生物材料，每次分离样品的容量比较大研究纯品大分子物质，推断其纯度、形状和相对分子质量等性质，每次分析的样品容量很小离心机分类离心机分类1、低速离心机•最大转速4000～7000rpm左右，最大相对离心力近2220～9420g，容量为几十毫升至几升，分离形式是固液沉降分离，转子有角式和外摆式，其转速不能严格控制，通常不带冷冻系统，于室温下操作。•用于收集易沉降的大颗粒物质，如红血球、酵母细胞等。2、高速冷冻离心机•最大转速为15000～26000rpm左右，最大相对离心力为16100～801100g，最大容量可达3升，分离形式也是固液沉降分离，转头配有各种角式转头、水平式转头、区带转头、垂直转头和大容量连续流动式转头、一般都有制冷系统，转速、温度和时间都可以严格准确地控制，并有指针或数字显示。•通常用于微生物菌体、细胞碎片、大细胞器、硫酸铵沉淀和免疫沉淀物等的分离纯化工作，但不能有效地沉降病毒、小细胞器(如核蛋白体)或单个分子。离心机分类3、超速离心机•转速可达55000～150000rpm，相对离心力最大可达363600～9011000g，离心容量由几十毫升至2升，分离的形式是差速沉降分离和密度梯度区带分离，离心管平衡允许的误差要小于0.1克。•超速离心机能使过去仅仅在电子显微镜下观察到的亚细胞器得到分级分离，还可以分离病毒、核酸、蛋白质和多糖等。离心机分类依材质分类：•铝合金：较轻,耐受强度较弱,适合在较低的转速下使用•钛合金：耐受强度不错,重量也比不锈钢轻•不锈钢：耐受强度最好,但材质本身太重•碳纤维：具有抗各种腐蚀的能力，重量只有铝合金转子的二分之一,钛合金转子的五分之一，使用寿命更长。离心机转子种类•角转子（anglerotor）•甩平转子（swingingbucketrotor）•垂直转子（verticaltuberotor）•区带转子（zonalrotor）•连续流动转子（continuousflowrotor）离心机转子种类依外形分类：•角转子：离心管放置的位置与转头的旋转轴之间成一个固定角度，通常在14-40℃之间。•适用于差速离心，也可用于等密度离心。•特点：容量大，转头内容纳的离心管多。角转子（anglerotor）离心机转子种类DriveshaftholeRotorcoverPackingThreadportionTubecavity离心机转子种类Rotorbody角转子的特点：•重心低,转速可较高•样品粒子穿过溶剂层的距离略大于离心管的直径•“管壁效应”：有一定的角度,在离心过程中撞到离心管外壁的粒子沿着管壁滑到管底形成沉淀,此效应使最后在管底聚成的沉淀较紧密。离心机转子种类•甩平转子：离心管组装在转子的吊桶里，离心机处于静止状态时离心管为垂直方向，即离心管与离心轴承平行方向。离心时离心管与旋转轴垂直。•承受的最大离心速度在65,000r/min左右，最大离心力在400,000×g。•适合于密度梯度离心，进行差速离心效果不理想。甩平转子（swingingbucketrotor）离心机转子种类甩平转子运行状态600rpm/min离心机转子种类甩平转子的特点：•转子的重心位置较高，转速较低•样品粒子沉降穿过溶剂层的距离大于直径•对于多种成分样品分离特别有效•常用于速率区带离心和等密度离心离心机转子种类垂直转子（verticaltuberotor）离心机转头种类•垂直转子：是指离心管与旋转轴成平行方向，离心管垂直插入转子孔内，在离心过程中始终与旋转轴平行。•承受的最大离心速度在100,000r/min左右，最大离心力在700,000g。•比较适合速率区带离心和等密度离心，尤其适合于质粒DNA的分离纯化，但不适合于差速离心。转头停止状态起始开始分离完全分离减速停止垂直转头的运行状态离心机转头种类•当转子旋转时，离心管中的液体层改变方向，从开始的水平方向改成垂直方向，当转子降速时，垂直分布的液层又逐渐趋向水平，待旋转停止后，液面又完全恢复成水平方向。•为一空腔，没有离心管，样品液直接放在腔内。•适用于大量样品的分离。•最大离心速度：60,000rpm左右•最大离心力：250,000×g区带转头（zonalrotor）离心机转头种类•由转子桶和有入口和出口的转头盖及附属装置组成，离心时样品液由入口连续流入转头，在离心力作用下，悬浮颗粒沉降于转子桶壁，上清液由出口流出。连续流动转头（continuousflowrotor）离心机转头种类•最大离心速度：32,000rpm左右•最大离心力：100,000×g•可用于大量培养液或提取液的浓缩与分离•塑料离心管：聚乙烯（PE）管、纤维素（CAB）管、聚碳酸酯（PC）管、聚丙烯（PP）管、异质同晶聚合物（PA）、聚氧化乙烯對苯二酸（PET），其中PP管性能较好。优点：透明（或半透明），易于观察；硬度小，可用穿刺法取出梯度。缺点：易变形，抗有机溶剂腐蚀性差，使用寿命短。•不锈钢离心管：强度大，不变形，能抗热，抗冻，抗化学腐蚀。离心管•沉淀离心•差速分级离心•密度梯度离心离心分离方法•沉淀离心是应用最广的一种离心方法，一般是指介质密度约1g/ml，选用一种离心速度，使悬浮溶液中的悬浮颗粒在离心的作用下完全沉淀下来。•主要适宜于细菌等微生物、细胞和细胞器等生物材料（密度在1.08-1.12g/ml左右）；病毒和染色体DNA等（密度在1.18-1.31g/ml左右）。•沉降速度与离心力和颗粒大小有关。离心分离方法沉淀离心（pelleting）沉淀离心示意图离心分离方法•建立在颗粒的大小、密度和形状有明显的不同，沉降系数存在较大差异的基础上进行分离的方法。•差速离心比较适用于大小相差明显的细胞或细胞器的分级分离，经过多次离心可以得到满意结果。•沉降顺序：整个细胞或细胞碎片——核——线粒体——溶酶体与过氧化物酶体——内质网与高基体——核蛋白体。•差速离心每次得到的沉淀物都含有极少量的小于该s值的沉淀物质。差速离心（differentialvelocitycentrifugation）离心分离方法差速离心示意图离心分离方法LowspeedHighspeed例：一个体积为100mL悬浮液中有三种物质A、B、C，沉降系数分别为100S、10S、1S。采用差速离心的方法分离。第一步：物质A的沉降。A100％沉淀时，沉淀物中有10％的B和1％的C。多次沉淀纯化物质A。组分沉降系数/S第一次第二次第三次沉淀％上清％沉淀％上清％沉淀％上清％A1001