肿瘤分子生物学

四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室（TEL:[phone])分子肿瘤学(MolecularOncology)朱文肿瘤(Tumor)肿瘤是机体中正常细胞，在不同始动与促进因素长期作用下所产生的增生与异常分化所形成的新生物良性恶性肿瘤(tumor)Carcinoma癌Sarcoma肉瘤Leukemia白血病癌症(cancer)肿瘤的特点1不受控制的异常生长(新生物一旦形成，不因病因消除而停止增生)2侵袭﹑转移3威胁生命﹑难以治愈4通过许多年变异和自然选择，癌细胞学会了多变，能规避人体精复杂的生长控制系统5打破消灭异常细胞的细胞自杀机制6进化出对免疫系统监视的抵抗力。目前肿瘤治疗的现状诊断：中、晚期治疗：放射治疗、化学治疗、手术治疗（盲目、被动）近40余年,美国政府耗资1000亿用于肿瘤的研究和治疗原因:基因组改变—信号转导异常—细胞转化—细胞恶性增殖等的机制不确定肿瘤发病机理的研究历史1775年:英国内科医生PercivalPott发现肿瘤的发生与环境因素有关1838年:Muller首次提出肿瘤发生是由于正常细胞结构破坏的累积所致,导致实验肿瘤学的诞生1952年:Boyland第一次证明了致癌物主要作用于DNA而非酶和蛋白质1964年:Brooks用实验证明致癌物可以使DNA发生突变,同时也明确了某些致癌物的致癌性与DNA亲合性之间有直接关系1969年:Harris提出恶性肿瘤中可能有一种抑制肿瘤恶性生长的基因1970年:认为肿瘤的发生﹑发展是环境和遗传因素相互作用的结果，确立了环境致癌和遗传因素与细胞癌变关系(一）外界因素1.化学因素:(1)烷化剂：如有机农药、硫芥等(2)多环芳香烃化合物：3﹑4-苯并芘(3)氨基偶氮类：染料类(4)亚硝胺类(5)真菌毒素和植物毒素：黄曲霉菌、苏铁素等(6)其他：重金属2.物理因素(1)电离辐射(2)紫外线(3)其他：石棉纤维﹑滑石粉3.生物因素主要是病毒感染：如EB病毒﹑乙型肝炎病毒、人乳头状瘤病毒(二）内在因素1.遗传因素（DNA损伤修复功能）2.内分泌因素3.免疫因素基因组遗传型、表型和环境的相互作用环境因素物理因素化学因素生物因素体内微环境做“人”很难人类基因组分子肿瘤学应用分子生物学理论阐明肿瘤发生﹑发展及其本质,运用分子生物学技术研究肿瘤相关基因及其表达产物在肿瘤发生、发展中的作用,为肿瘤的预防﹑诊断和治疗提供新措施的一门学科从根本上揭示肿瘤发生发展的机制，是目前肿瘤学研究的基石目前国际上对于肿瘤发生分子机制的基础研究主要集中在以下三大领域:1.肿瘤相关基因的克隆和功能分析2.细胞信号传导通路3.细胞周期调控肿瘤产生的分子基础1953年沃森和克里克提出了DNA的双螺旋结构，他们在Nature上写道:这种结构具有在生物学上相当重要的新特征DNA结构和中心法则的发现，使肿瘤分子生物学的研究取得了突破性的进展,为研究基因缺陷与肿瘤的关系开创了一个新时代ATATGGGTACGGTTATACCCATGCCAATGCGTAGTTACGATCA遗传物质的半保留复制理论遗传物质DNA通过半保留复制法,将亲本的遗传物质分别完全一样传送入两个子代细胞中,保证了遗传的稳定性DNA分子的结构改变DNA分子的自发断裂和碱基的丢失DNA的自我复制造成的错误各种各样的致癌剂对DNA分子的损伤病毒的DNA分子可整合到细胞的DNA中去,引起DNA结构的改变DNA分子结构改变最基本的方式碱基对的改变的主要形式有:替代、缺失、插入、颠换致癌剂对DNA分子的损伤碱基二聚体形成碱基加合物形成碱基缺失碱基取代和碱基错配致癌剂对DNA的损伤DNA加合物的形成是DNA分子结构改变的重要方式之一致癌物转化为DNA加合物及其后果病毒对DNA分子的损伤RNA病毒基因整合到细胞DNA的基因组上,引起基因的突变DNA损伤使DNA分子的结构﹑性质和功能发生改变维持DNA损伤的存在和积累,存在于DNA分子上的基因就会改变基因的改变细胞癌变肿瘤是一种环境因素与遗传因素相互作用导致的疾病,大多数的环境致病因素的致癌作用都是通过影响遗传基因起作用的肿瘤的发生是由于细胞中基因改变积累的结果，包括（1）癌基因的激活、过度表达（2）抑癌基因的突变、丢失(3）微卫星不稳定，出现核苷酸异常的串联重复分布于基因组（4）错配修复基因突变，导致细胞遗传不稳定或致肿瘤易感性癌基因(Oncogene)Oncogenesareessentialforhumanlifeactivity,whosenormalfunctionistocontrolcellulargrowthanddifferentiation/apoptosisor,indifferentterms,cellbirthandcelldeath.Correspondingly,theirstructuraland/orfunctionalalterationsleaduncontrolledcellulargrowthandabnormaldifferentiation/apoptosis原癌基因（proto-oncogene)细胞中固有的基因，在正常情况下参与细胞的增殖与分化的调控,是调控细胞增殖与分化的一类基因,当基因结构和功能发生变异并使细胞发生恶性转化时，这样的基因才叫癌基因(oncogene).由于细胞癌基因在正常细胞中以非激活形式存在，故又称为原癌基因.原癌基因的特点广泛存在于生物界中，从酵母到人的细胞普遍存在在进化进程中，基因序列呈高度保守性它的作用是通过其表达产物蛋白质来体现的；它们的存在对正常细胞不仅无害，而且对维持正常生理功能、调控细胞生长和分化起重要作用，是细胞发育、组织再生、创伤愈合等所必需在某些因素（如放射线、某些化学物质等）作用下，一旦被激活，发生数量上或结构上的变化时，就会形成癌性的细胞转化基因癌基因研究的发展历史1969年,Rous医生等在研究鸡肉瘤时发现罗氏肉瘤病毒（RousSarcomaVirus,RSV)1975年,Bishop从RSV中分离到第一个病毒癌基因（v-Src)，Src基因编码60-kDa的酪氨酸蛋白激酶1976年,Sehelin以实验证明正常鸡成纤维细胞基因组中存在有病毒癌基因v-Src的同源序列c-SrcHuebnerRJ,TodaroGJ.OncogenesofRNAtumorvirusesasdeterminantsofcancer.ProcNatlAcadSciUSA.1969,64(3):1087-94.1982年Weinberg等通过基因转染技术从不同的人膀胱癌细胞系中分离到具有致癌活性的活化癌基因H-ras，并发现其相对应的细胞原癌基因之间只有一个碱基对的区别目前已发现100多种癌基因包括Ras、c-myc、Bcl-2等原癌基因的种类生长因子受体信号转导分子转录因子细胞程序性死亡及凋亡蛋白细胞周期蛋白细胞核细胞浆细胞膜分泌到胞外生物学功能存在位置人类肿瘤中原癌基因的激活途径Over-expression原癌基因基因扩增Over-expression点突变Structural/functionalchange染色体重排Over-expressionorproteinwithnovelactivities1.点突变与癌基因原癌基因点突变结构功能的改变癌基因激活的主要方式在基因的编码顺序上一个碱基对被另一碱基对所置换乳腺癌﹑肺癌﹑肝癌﹑结肠癌等癌细胞中均发现了H-ras原癌基因的点突变癌基因变异方式和活化点突变经常可以在Ras原癌基因家族(K-Ras,H-RAS,N-Ras)中检测到人类肿瘤中主要是K-ras第12位密码子GGC变为GTC,编码的氨基酸由甘氨酸变为颉氨酸，这样其产物p21-Ras蛋白的结构发生变化而导致基因的活化30%的肺癌、50%结肠癌、90%胰腺癌中有K-Ras突变点突变的检测方法限制性内切酶长度多态性（restrictionendonucleasefragementlongthpolymophism,REFLP)单链构向多态性（singlestrandconformationpolymorphism,SSCP)寡核苷酸探针杂交变性高压液相色谱（DHPLC）PCR直接测序2.DNA扩增和癌基因原癌基因基因扩增Over-expression癌基因活化的另一种主要方式细胞内一些基因通过不明原因复制成多拷贝原癌基因拷贝数的增加会导致基因产物的增加,从而引起细胞正常功能的紊乱原癌基因myc,erbB和Ras的扩增在人类肿瘤中最为常见染色体重排Over-expressionorproteinwithnovelactivities原癌基因原癌基因中染色体某一部分从一个位置移动到另一位置,使原癌基因的结构改变,使原癌基因激活,这种改变称为基因重排通过对肿瘤组织和细胞系的染色体分析，发现在各种肿瘤中都有染色体结构的异常。染色体易位在血液系统的肿瘤中最为常见3.染色体重排与癌基因ChromosomesinvolvedinthePh-translocation.Bandedchromosomes9and22areshown,aswellastheproductsofthet(9;22)includingthe9q+and22q-(Ph)chromosomesTranslocations-Bcr/AblOncogene21;8536-8540(2002)4.基因缺失与癌基因肿瘤细胞中常发现有原癌基因DNA片段缺失，原癌基因内小的缺失，可使在正常情况下抑制蛋白活性的那部分蛋白缺失或诱导产生类似于正常的刺激信号，导致细胞的过度增殖5.原癌基因的甲基化改变DNA甲基化DNA甲基化是一种表观遗传修饰，它是由DNA甲基转移酶（DNAmethyl-transferase,Dnmt）催化S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶（mC）的一种反应在真核生物DNA中，5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化学性修饰碱基在人类基因组DNA中，约3％～4%的胞嘧啶碱基以5-甲基胞嘧啶形式存在大约70％～80％的5-甲基胞嘧啶存在于CpG序列中，CpG二核苷酸集中的区域称之为CpG岛限制性内切酶HapII和MspI均能识别CCGG,但不能识别CmCmGGDNA甲基化的生物学功能通过基因启动子区及附近区域CpG岛胞嘧啶的甲基化可以在转录水平调节基因的表达，从而引起相应基因沉默，去甲基化又可恢复其表达DNA的甲基化对维持染色体的结构和肿瘤的发生发展都起重要的作用,是细胞癌变过程中的重要一步肿瘤中DNA甲基化的作用肿瘤局部相关基因的高甲基化：肿瘤抑制基因沉默肿瘤中整体的低甲基化：肿瘤中整体的低甲基化肿瘤组织相对于正常组织整体呈现低甲基化状态目前有3种机制解释基因组整体的低甲基化在肿瘤中所扮演的作用：1.低甲基化导致原癌基因的去甲基化失活，导致癌基因的大量表达（Myc基因）2.整体的低甲基化是细胞染色体不稳定的易感因素3.低甲基化使肿瘤转移增加,DNA甲基化水平愈低肿瘤的浸润能力就越高，临床分期也愈晚肿瘤局部相关基因的高甲基化近几年研究发现,在癌细胞中,肿瘤抑制基因甲基化的发生率与肿瘤抑制基因突变或缺失发生的概率大致相等,均可导致肿瘤抑制基因功能的丧失，如结肠癌、胃癌中hMLH1基因高甲基化导致DNA错配修复的缺失；脑肿瘤、结肠癌中MGMT基因的高甲基化导致化疗敏感性降低。一些DNA甲基化抑制剂,例如5-氮杂胞苷和5-氮杂脱氧胞苷可以使失活的肿瘤抑制基因恢复其正常功能,为白血病和其他相关疾病的治疗提供了新的手段。肿瘤中DNA甲基化的应用肿瘤筛查和风险评估：甲基化检测能够有效预测不同肿瘤中个体的风险率肿瘤病理分型和治疗：甲基化指标的鉴定有助于肿瘤的临床病理分型，体外应用DNA甲基化抑制剂活化沉默的高甲基化基因肿瘤治疗监测：一个或者多个基因的甲基化状态与肿瘤的复发或者生存率相关DNA甲基化研究