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PCR引物及杂交探针设计主讲教师：赵雨杰DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火（复性）--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至90~95℃一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至50～60℃，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于70～75℃，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。（230=1073741824）PCR反应五要素：引物酶dNTP模板缓冲液（其中需要Mg2+)PCR引物的设计原则1.引物应用模板核酸序列保守区内设计并具有特异性。2.引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段，产物不能形成二级结构。3.引物长度一般在15~30碱基之间。4.G+C含量在40%~60%之间。5.碱基要随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。6.引物自身不能有连续4个碱基以上的互补。7.引物之间不能有连续4个碱基以上的互补。8.引物5′端可以修饰。9.引物3′端不可修饰。PCR引物区域选择Primer3Plus主讲教师：赵雨杰Primer-BLAST主讲教师：赵雨杰=BlastHome实时定量RT-PCR主讲教师：赵雨杰实时定量PCR原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。1.TaqMan荧光探针:PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变(SNP)，有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。2.SYBR荧光染料:在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR仅与双链DNA进行结合，因此可以通过溶解曲线，确定PCR反应是否特异。3.分子信标:是一种在5和3末端自身形成一个8个碱基左右的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，导致荧光基团与淬灭基团紧紧靠近，不会产生荧光。PCR产物生成后，退火过程中，分子信标中间部分与特定DNA序列配对，荧光基因与淬灭基因分离产生荧光。根据mRNA序列设计RT-PCR引物1、引物和探针的特异性2、引物扩增的效果3、扩增产物在mRNA的位置4、能否鉴别基因组DNA的污染数据库查询RT-PCR引物方法GenScriptReal-timePCR(TaqMan)PrimerDesign://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/DNA甲基化特异性PCR引物设计主讲教师：赵雨杰亚硫酸氢钠修饰DNA的目的是将DNA序列中未甲基化的胞嘧啶完全转化为尿嘧啶，而甲基化的5-甲基胞嘧啶保持不变。MSP需要特殊要求：1、甲基化引物、非甲基化引物。Tm差异不能太大。2、甲基化引物和非甲基化引物带有至少一个CpG序列，越多甲基化位点越好。至少有一个CpG序列在引物3’端。最好设计一对野生型引物来验证模板。3、M和U同时出现条带，说明这个甲基化位点是半甲基化的，或者你的模板没修饰完全。4、MSP的可靠性，最终还是要用测序来确定。Meth'Primer甲基化PCR引物设计软件碱基增加1000miRNA数据库检索及实验设计主讲教师：赵雨杰Micro(mi)RNAsaresmall,highlyconservednoncodingRNAsthatcontrolgeneexpressionpost-transcriptionallyeitherviathedegradationoftargetmRNAsortheinhibitionofproteintranslation.EachmiRNAisbelievedtoregulatetheexpressionofmultiplemRNAtargets,andmanymiRNAshavebeenlinkedtotheinitiationandprogressionofhumancancer.miRNAscontrolvariousactivitiesoftheimmunesystemanddifferentstagesofhematopoieticdevelopment,andtheirmisexpressionisthecauseofvariousbloodmalignancies.CertainmiRNAshaveoncogenicactivities,whereasothershavethepotentialtoactastumorsuppressors.Becausetheycontrolfundamentalprocessessuchasdifferentiation,cellgrowthandcelldeath,thestudyoftheroleofmiRNAsinhumanneoplasmsholdsgreatpromisefornovelformsoftherapy.miRNAmap主讲教师：赵雨杰miRBase主讲教师：赵雨杰miRNA引物设计主讲教师：赵雨杰由于miRNA序列较短；由于miRNA存在成熟和颈环序列；用实时定量PCR检测生物样品中某种miRNA含量引物设计是比较特殊的；首先，需完成miRNA逆转录；然后，进行扩增。1、Oligod(T)特异的RT引物（QIAGEN产品为主）由特异序列＋(T)20左右＋兼并碱基V或VN组成。但是RNA在反转录前需要进行末端Poly(A)加尾，所有miRNA可以公用一个Oligod(T)的RT引物，该引物含有一段PCR引物。另外一条引物3'端含有6-8个目标miRNA5'端碱基序列，再加一段随机序列，以确保引物的Tm值在60℃左右。2、茎环状结构的RT引物（ABI产品为主）由可以自身呈环茎状的特异序列＋6到8个miRNA3’端反向互补碱基组成。(一条miRNA序列特异对应一个茎环状结构的RT引物）。另外一条引物3‘端含有6-8个目标miRNA5'端碱基序列，再加一段随机序列，以确保引物的Tm值在60℃左右。美国signosis公司的一种新方法美国Signosis开发了一种高灵敏、高分辨的实时PCR方法，用于检测miRNA的表达，其应用寡核苷酸连接和基于实时PCR的SYBRgreen荧光染料。该方法可用于总RNA或细胞裂解物中的miRNA表达的定量分析，无需进行cDNA转换。该方法中，靶miRNA分子与两对oligo连接，形成RNA/DNA复合物。当序列完全匹配时，这两对oligo与miRNA连接，两对oligo的节点通过DNA酶连接。miRNA之间单个寡核苷酸的差异就会阻止杂交或连接。寡核苷酸对连接上后，连接分子可进行实时PCR。