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1.2基因工程的基本操作程序专题一基因工程补充：基因的结构基因的定义遗传效应是指能转录为mRNA，继而翻译为蛋白质，或转录为核糖体RNA、转运RNA的功能。什么是遗传效应？基因是有遗传效应的DNA片段。是决定生物性状的基本单位。染色体蛋白质DNA基因线性排列脱氧核苷酸磷酸基＋脱氧核糖＋含氮碱基遗传物质的主要载体具有遗传效应的DNA片段（DNA的基本单位）基因、DNA、染色体、脱氧核苷酸的关系原核生物的基因结构编码区非编码区非编码区RNA聚合酶结合位点编码区：能转录为相应的mRNA进而指导蛋白质的合成。非编码区：不能转录为相应的mRNA但有调控遗传信息表达的核苷酸序列，位于编码区的上游和下游。区分：启动子与起始密码终止子与终止密码起始密码终止密码启动子终止子ATC基因转录区TAA转录ATC转录起始点翻译起始点转录终止点RNA起点RNA终点真核生物的基因结构编码区非编码区非编码区RNA聚合酶结合位点外显子内含子信使RNA成熟的信使RNA1.简述基因工程原理及基本操作程序。2.尝试设计某一转基因生物的研制过程。学习目标基因操作的基本步骤1.提取目的基因2.目的基因与运载体结合(基因表达载体的构建)3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的检测与鉴定基因工程的操作步骤①目的基因的获取；②表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与鉴定。基因工程的原理：“按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。如：抗虫基因、抗病基因、人胰岛素基因、人干扰素基因等温故知新为什么要有这一步基因工程的操作步骤第一步：获取目的基因（1）目的基因：主要是指编码蛋白质的基因，例如，与生物抗逆性相关的基因、与优良品质、生物药物和保健品、毒物降解以及工业用酶相关的基因等，也可以是一些具有调控作用的因子。基因工程的操作步骤第一步：获取目的基因（2）现代获取方法：①从基因文库中获取目的基因（目的基因的序列未知）②利用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增目的基因（目的基因的序列部分已知）③人工合成目的基因（目的基因的序列已知，基因较小）初始目的基因的来源从生物中直接获取人工合成获取目的基因方法①：从基因文库中获取目的基因基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。基因文库基因组文库cDNA文库某生物体内全部DNA许多DNA片段受体菌群体限制酶与载体连接导入基因组文库某种生物某个时期的mRNAcDNA反转录受体菌群体与载体连接导入部分基因文库（cDNA文库）基因组文库与cDNA文库的比较文库类型cDNA文库基因组文库文库大小基因中有无启动子基因中有无内含子基因多少物种间的基因交流小大无无有有可以部分基因可以某种生物的部分基因某种生物的全部基因如何从基因文库中获取目的基因？就像从图书馆借一本书，要知道书名、作者、出版社或人物情节等信息一样获取目的基因前，要对这个基因的背景有一定程度的了解，（如核苷酸序列、基因的功能、位置以及基因的表达产物的特性等）然后通过恰当的技术手段将目的基因从基因文库中调取出来。获取目的基因方法②：利用PCR技术扩增目的基因全称是：多聚酶链式反应，在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。可以在短时间内大量扩增的目的基因。DNA复制的过程涉及DNA双链的方向。通常将DNA的羟基（-OH）末端称为3’端，而磷酸基团的末端称为5’端。5’端3’端3’端5’端DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3’端延伸DNA链。因此，DNA复制需要引物。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3’端开始延伸DNA链。DNA的合成方向总是从子链的5’端端向3’端端延伸3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’复习：DNA复制DNA复制的过程1.解旋:利用细胞提供的能量边解旋、边复制2.配对:分别以每条单链为模板,以四种游离的脱氧核苷酸为原料,利用碱基互补配对原则合成两条新的子链3.螺旋：两条子链分别与对应的模板链绕成螺旋型，构成两个新的DNA分子DNA复制方式：半保留复制思考：DNA复制需要哪些成分和反应条件？如何在体外设置一个类似的DNA复制环境？参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶打开DNA双链DNA母链（模板链）提供DNA复制的模板4种脱氧核糖核苷酸合成子链的原料DNA聚合酶催化合成DNA子链引物使DNA聚合酶能够从3’端开始连接脱氧核苷酸DNA双链复制的原理（遵循碱基互补配对原则）•含待扩增目的基因片段的DNA模板；•根据目的基因双链各一端序列片段合成与两条模板链相结合的两种引物；•要有耐热的DNA聚合酶（Taq酶）；•四种单核苷酸（dCTP、dGTP、dATP、dTTP）。基本条件：PCR技术依据的原理：DNA热变性的原理前提条件：有一段已知目的基因的核苷酸序列变性复性延伸55-60℃1.DNA变性：加热至90-95℃，DNA片段受热后氢键断裂，形成单链；2.复性：冷却至55-60℃，引物结合到互补DNA链；3.延伸：加热至70-75℃，耐热的DNA聚合酶从引物起始引导互补链的合成。PCR第一轮过程：结果：使目的基因在短时间内成百万倍的扩增目的基因以指数方式扩增，即2n获取目的基因方法③DNA合成仪用化学方法直接人工合成根据已知的氨基酸序列推知DNA序列蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列目的基因前提条件：基因比较小，核苷酸序列已知设备：DNA合成仪①目的基因的获取；②表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与鉴定。单独的目的基因（DNA片段）是不能稳定遗传的。为了使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能正常表达和发挥作用，必须构建表达载体。温故知新为什么要有这一步基因工程操作步骤的必要性第二步：基因表达载体的构建——基因工程的核心构建目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以以传给下一代。基因表达载体的组成：目的基因、启动子、终止子、标记基因等基因表达载体启动子：位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需蛋白质。终止子：位于基因的尾端，使转录在所需要的地方停止下来。标记基因：为了鉴别受体细胞中是否含目的基因，从而筛选出来。如：抗生素抗性基因目的基因标记基因质粒DNA分子限制酶处理两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同种一个切口两个黏性末端•为什么不能将目的基因直接导入受体细胞？通过cDNA文库获得的目的基因有启动子和终止子吗？•在构建表达载体（重组DNA分子）过程中需要什么分子工具？•只考虑两两结合，可产生几种重组DNA分子？三种不能稳定存在并表达。cDNA文库的目的基因中没有启动子和终止子.①目的基因的获取；②表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与鉴定。含有目的基因的表达载体只有进入受体细胞，并且维持稳定和表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。温故知新为什么要有这一步基因工程操作步骤的必要性第三步：将目的基因导入受体细胞转化：目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞中维持稳定和表达的过程，称为转化•常用的受体细胞：动植物细胞和大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌等微生物。•将目的基因导入受体细胞的原理借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。——转化农杆菌特点：生活在土壤中，能够在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，受植物体伤口处的细胞分泌的大量酚类化合物的吸引，农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。1）将目的基因导入植物细胞a.农杆菌转化法（采用最多的方法）原理：将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌转化，使目的基因进入植物细胞，并将其插入到植物细胞染色体的DNA上。使目的基因的遗传特性得以稳定的维持和表达。优点及应用：此法比较经济和有效，约80%的转基因植物都是通过这种方法获得。我国科学家独创的一种方法实例：我国的转基因抗虫棉（1）常用于单子叶植物的基因转化（2）缺点：成本较高基因枪法花粉管通道法2）将目的基因导入动物细胞提纯基因表达载体体外显微注射入受精卵经胚胎早期培养后移植到雌性体内受体细胞：显微注射技术基本操作程序：原因是：受精卵全能性较高，可使外源基因在相应的组织细胞内表达。受精卵最常用的方法:1）早期基因工程为什么选用原核生物作为受体细胞？原核生物繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少2）应用最为广泛的受体细胞是大肠杆菌3）方法：3）将目的基因导入微生物细胞a.用Ca2+处理细胞（以增加细菌细胞壁的通透性），使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞；b.是将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。思考4:利用大肠杆菌能生产人的糖蛋白吗?有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链,这些糖链是在内质网和高尔基体上加工完成.大肠杆菌是原核生物,不存在这两种细胞器,因此在大肠杆菌生产这种糖蛋白是不可能的.1.将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法基因枪法2.将目的基因导入动物细胞显微注射技术（最多、最有效）3.将目的基因导入微生物细胞Ca2+处理花粉管通道法小结基因工程操作步骤的必要性①目的基因的获取；②表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与鉴定。因为并不是所有受体细胞的DNA都接纳了目的基因、也并不是所有插入的目的基因都能正确表达，因此需要筛选。只有通过检测和鉴定，才能得知目的基因是否能够在受体细胞中稳定存在和正确表达。温故知新为什么要有这一步第四步：目的基因的检测和鉴定①检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因——DNA分子杂交DNA分子杂交技术【小组交流】阅读教材14页，讨论什么是DNA分子探针？检测时探针通过什么原理来检测目的基因？探针是一小段单链DNA或者RNA片段（约20到500bp），用于检测与其互补的核酸序列。根据重组质粒上目的基因的部分DNA序列，人工合成（或PCR技术合成）与之互补的一小段单链DNA（或RNA),利用带有32P-磷酸的dATP使其标记上放射性同位素，这一小段与目的基因的部分序列互补的核酸分子称为DNA探针。什么是DNA分子探针？DNA分子杂交技术互补碱基序列的DNA分子，可以通过碱基对之间形成氢键等，形成稳定的双链区。DNA分子杂交的双方是所使用的探针和要检测的核酸DNA分子杂交的理论基础是：基因探针与目的基因杂交，观察标记有无杂交带将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交不能，受体细胞必须合成相应的蛋白质或表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。•受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。第四步：目的基因的检测和鉴定①检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质——DNA分子杂交——分子杂交——抗原—抗体杂交分子水平检测抗原—抗体杂交从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原——抗体杂交，若有杂交带出现，表明目的基因已形成蛋白质产品。以上检测是分子水平，有时还需进行个体生物学水平的鉴定，如对植物的抗虫抗病特性的鉴定等。第四步：目的基因的检测和鉴定①检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质④是否赋予个体新的遗传特性——DNA分子杂交——分子杂交——抗原—抗体杂交分子水平检测个体水平鉴定基因工程的基本操作程序1、目的基因的获取2、形成重组DNA分子；3、将目的基因导入受体细胞4、筛选含有目的基因的受体细胞、目的基因表达1、从基因文库中获取目的基因2、利用