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38.串联质谱在定性卷烟中Amadori化合物的研究王军周宛虹陆益敏刘百战上海烟草（集团）公司技术中心摘要Amadori化合物（1-氨基-1-脱氧酮糖）是Maillard反应的关键中间产物，该类化合物能在不同的反应条件下生成各种芳香物质。在卷烟燃吸过程中Amadori化合物会反应生成多种具有芳香气味的小分子化合物，对卷烟烟气质量有重要影响，是卷烟中重要的一类前香物质。本文使用串联质谱方法定性研究卷烟中含有的多种Amadori化合物，研究它们的质谱规律。通过使用电喷雾离子源正离子模式（ESI+）以及使用选择离子扫描模式（SIM），选择分子离子[M+H]+为母离子，再做母离子的二级质谱（MS2）；并对所得质谱数据进行分析，总结出Amadori化合物质谱定性方法和质谱碎裂规律。串联质谱是定性分析烟草中Amadori化合物的一种有效方法。关键词Maillard反应，Amadori化合物，烟草前香物，卷烟，串联质谱QualitativeAnalysisofAmadoriCompoundsinCigarettebyTandemMassSpectrometryWangJun,ZhouWanhong,LuYimin,LiuBaizhanTheTechnicalCenterofShanghaiTobacco(group)Company,Shanghai,200082,ChinaAbstract:Amadoricompoundsare1-amino-1-deoxyketosesrepresentingakeyclassofMaillardreactionintermediates.Amadoricompoundscanyieldnumerousaromaticsubstancesunderdifferentreactionconditions.Duringcigarettebeingburned,Amadoricompoundsproduceabundantfragrantmolecules,whichplayanimportantroleinthequalityofsmoke.Therefore,Amadoricompoundsareimportantprecursorsoftobaccoaroma.Inthispaper,tandemmassspectrometrywasappliedtoqualitativelyanalyzeAmadoricompoundsincigaretteandtheruleoftheirmassspectrometrywasresearched.Positiveelectrosprayionization(ESI+)modewasusedintheexperiment.Themoleculeions[M+H]+ofAmadoricompoundswereselectedbySIM(SelectedIonMonitoring)modeandthenthetandemmassspectrometryMS2wasacquiredfromtheprecursorions.AccordingtotheanalysisofMS2,wesummarizedthemassspectrometryanalysismeansandthemainfragmentationpathwaysofthemoleculeions[M+H]+ofAmadoricompounds.TandemmassspectrometryisanefficientmethodtoqualitativelyanalyzeAmadoricompoundsintobacco.Keywords:Miallardreaction;Amadoricompound;Precursoroftobaccoaroma;Cigarette;Tandemmassspectrometry1前言Maillard反应是一类非酶促棕色化反应，是氨基化合物和羰基化合物之间进行的一系列复杂反应[1-2]。在烟草、食物加热以及储存过程中，还原糖的羰基与氨基酸的氨基之间发生Maillard反应，这类反应是影响烟草、食品香味和颜色的重要反应[3]。在烟叶调制、醇化以及卷烟加工、贮藏、燃吸等过程中Maillard反应始终在发生，是形成均衡、丰富烟气香味不可缺少的方面。1953年，J.E.Hodge通过研究总结了Maillard反应的规律[4]（如图1所示）。葡萄糖+氨基酸N-取代葡萄糖胺+H2OAmadori重排产物（1-氨基-1-脱氧-2-酮糖）Amadori重排糠醛或羟甲基糠醛席夫碱还原酮-3H2O-2H2O裂解产物（丙酮醇，丙酮醛，二乙酰化合物等）-氨基化合物+H2O羟甲基糠醛或糠醛+氨基化合物醛亚胺类-2H+2H脱氢还原酮类黑素（棕色含氮聚合物和共聚物）有或没有氨基化合物醛（酮）醇类聚合物+氨基化合物醛亚胺或酮亚胺类CO2醛类+醛亚胺类+氨基酸Strecker降解+氨基化合物+氨基化合物图1.Maillard棕色化反应Hodge路线从图1可以看出，通常Maillard反应经历三个阶段：反应早期，反应中期和反应高级阶段。反应早期还原糖和氨基酸首先相互作用，重排生成Amadori化合物；反应中期Amadori化合物发生脱水、环化、裂解等一系列反应生成大量影响食品、烟草风味的物质，如醛酮类、呋喃类、吡喃类、吡咯类、吡嗪类等化合物[5]；另外一部分产物在反应高级阶段发生聚合反应生成具有棕色到黑色的高分子聚合物“类黑素”。“类黑素”对烟草和食品的颜色以及味道也具有重要影响（如图2所示）。反应早期糖和氨基首先相互作用反应中期裂解，环化，脱水缩合以及寡聚风味物质气味，味道反应高级阶段聚合反应高分子“类黑素”颜色，味道Amadori重排产物图2.Maillard反应经历的不同阶段从图2可以看到Amadori化合物（1-氨基-1-脱氧酮糖）是Maillard反应的关键中间产物，它是Maillard反应初期由N-取代葡萄糖胺转化而来[6]（如图3所示）。CHOOHHHHOOHHOHHCH2OH+H2NCHRCOOHCHOHOHHHHOOHHOHHCH2OHNHCHRCOOH-H2OCHOHHHHOOHHOHHCH2OHNCHRCOOHN-取代葡萄糖胺(Schiff碱)CHCOHHHOOHHOHHCH2OHNHCHRCOOHCH2OHHOOHHOHHCH2OHNHCHRCOOH1-氨基-1-脱氧-2-酮糖(Amadori重排产物)图3.还原糖（葡萄糖）与氨基酸反应生成Amadori化合物的过程Maillard后续反应是从Amadori化合物开始进行，Amadori化合物自身是没有芳香气味的非挥发性物质，但它能在不同的反应条件下以及卷烟燃吸过程中生成各种芳香物质，已经发现Amadori化合物是烟草[7]和食品的重要前香物质。因此，对卷烟中该类化合物的定性研究对深入了解Maillard反应，改善卷烟质量，提高卷烟香气都具有重要意义。质谱不仅具有很高的灵敏度，而且还具有优良的选择性，是对化合物定性研究的有效工具。本文中我们使用4000Q-Trap型质谱仪对卷烟中的多种Amadori化合物进行定性研究，总结这些化合物的质谱碎裂规律，并对碎裂方式进行合理推导。2实验部分2.1实验仪器4000Q-Trap型串联四极杆线性离子阱质谱仪（美国ABI公司）Harvard连续进样器2.2实验试剂与卷烟样品处理方法甲醇（色谱纯）去离子水（Milli-Q系统纯化）甲酸（分析纯）120mg的中华牌卷烟烟丝（硬盒，焦油含量15mg）放入50mL的锥形瓶中，加入15mL的水和甲醇的混合溶液(1:1/V:V),超声10分钟，浸泡15小时后再超声10分钟。取上层清夜，用纤维素滤膜（0.45μm）过滤，取1mL滤液用2mL的0.1%甲酸混合溶液（水：甲醇=1:1/V:V）稀释。2.3实验方法用连续进样器向4000Q-Trap质谱进样，流速为5μL/min。质谱使用选择离子扫描(SIM)模式和MS2(ProductIonScan)扫描模式。离子源为ESI正离子模式（ESI+），离子源喷雾电压(IS)为5500V。气帘气压(CG)10psi，离子源喷雾气压（GS1）12psi，进口电压(EP)10V，解簇电压(DP)根据不同化合物分别实验优化，结果如表1所示。MS2实验用高纯氮气为碰撞气体，碰撞气(CAD)设为Medium，碰撞电压(CE)20V-25V，根据不同化合物分别实验优化，结果如表1所示。碰撞池出口电压(CXP)10V，Q1和Q3的分辨率为Unit。数据分析使用Analyst1.4.1软件。表1Amadori化合物DP和CE值优化结果Amadori化合物DP电压(V)CE电压(V)1-脱氧-1-L-丙氨酸-D-果糖（Fru-Ala）42201-脱氧-1-L-缬氨酸-D-果糖（Fru-Val）46201-脱氧-1-L-亮氨酸-D-果糖（Fru-Leu）48201-脱氧-1-L-脯氨酸-D-果糖（Fru-Pro）43201-脱氧-1-L-苯丙氨酸-D-果糖（Fru-Phe）42251-脱氧-1-L-色氨酸-D-果糖（Fru-Trp）55251-脱氧-1-L-丝氨酸-D-果糖（Fru-Ser）47251-脱氧-1-L-天冬酰胺-D-果糖（Fru-Asn）49253结果与讨论将处理过的样品溶液按照上述的实验方法进行各种Amadori化合物的质谱图采集实验。在中华牌卷烟烟丝（硬盒，焦油含量15mg）中检测到多种Amadori化合物，每种Amadori化合物分别做各自的MS2质谱图。以1-脱氧-1-L-脯氨酸-D-果糖(Fru-Pro)的MS2质谱图为例（如图4所示）。+MS2(278.00)CE(20):10MCAscansfromSample2(fru-pro)offru-pro(0718).wiff(TurboSpray),CentroidedMax.3.8e7cps.60708090100110120130140150160170180190200210220230240250260270280290300m/z,amu5%10%15%20%25%30%35%40%45%50%55%60%65%70%75%80%85%90%95%100%RlIt(%)163.1260.1242.1278.0128.0232.0116.1213.9157.8187.9132.1173.184.1105.8149.098.0217.8195.870.1H2COHHOOHHOHHCH2OHNCOOHH+[Fru-Pro+H]+图41-脱氧-1-L-脯氨酸-D-果糖分子离子[Fru-Pro+H]+的MS2质谱图根据每种Amadori化合物的MS2质谱图总结出它们各自的分子离子[M+H]+和[M+H]+的MS2离子碎片质荷比(m/z)，（如表2所示）。表2Amadori化合物的MS2数据总结Amadori化合物[M+H]+(m/z)[M+H]+的MS2离子(m/z)Fru-Ala252.0252.0，234.0，216.0，205.9，188.0，163.1，102.0，90.0Fru-Val280.1280.1，262.1，244.2，234.1，216.2，163.1，129.9，118.2Fru-Leu294.1294.1，276.2，258.1，248.1，230.1，163.2，132.2，115.9Fru-Pro278.0278.0，260.1，242.1，232.0，213.9，163.1，128.0，116.1Fru-Phe328.1328.1，310.1，292.1，282.0，264.1，178.1，166.2，163.1Fru-Trp366.9366.9，349.1，331.2，320.8，302.9，217.1，205.0，163.1Fru-Ser268.0268.0，249.9，232.0，221.8，204.0，135.9，118.