综述模板

综述朱兆华吴沛容化学化工学院摘要:1、圆二色光谱对研究蛋白质二级结构、构象变化以及其他手性化合物结构是很重要的。介绍了圆二色光谱技术在蛋白质和药物分子结构分析上的应用和实验方法。2、荧光分析法在生物技术的分析,免疫技术的分析,如DNA、抗体、抗原等。痕量元素的分析，如70多种无机元素，间接测定众多的有机物，包括药物等方面的应用。3、动态光散射DynamicLightScattering(DLS)，也称光子相关光谱PhotonCorrelationSpectroscopy(PCS)，准弹性光散射quasi-elasticscattering，测量光强的波动随时间的变化。DLS技术测量粒子粒径，具有准确、快速、可重复性好等优点，已经成为纳米科技中比较常规的一种表征方法。随着仪器的更新和数据处理技术的发展，现在的动态光散射仪器不仅具备测量粒径的功能，还具有测量Zeta电位、大分子的分子量等的能力。4、纳米材料是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围(1-100nm)或由它们作为基本单元构成的材料，这大约相当于10~100个原子紧密排列在一起的尺度。关键词:圆二色测量，荧光分析法，动态光散射分析法纳米材料1圆二色测量圆二色光谱是一种差光谱，是样品在左旋偏振光照射下的吸收光谱与其在右旋吸收光谱照射下的偏振光之差。物质的吸收光谱决定物质的颜色。如果一个物质对左旋偏振光和对右旋偏振光的吸收不同,那么称该物质具有圆二色性(circulardi2chroism,简称CD)。同样,如果一个物质对于不同方向的线偏振光的吸收不同,那么该物质具有线二色性。很多各向异性的晶体具有线二色性;而很多生物大分子和有机分子具有圆二色性。历史上,圆二色性又称为光学活性,巴斯德在19世纪就发现并研究了柠檬酸的光学活性。圆二色光谱是研究手性分子结构的重要工具。因为左旋光和右旋光互为镜面对称,所以镜面对称的结构对于左、右旋光的吸收不表现差异性。只有镜面不对称的结构,即手性结构才有可能对左、右旋光的吸收表现出差异性。由于生物大分子基本都含有手性的基团和结构,圆二色光谱可以帮助测量和观察生物大分子的结构和构象变化,因此圆二色光谱技术成为生物物理和生物化学研究中的一个非常重要的手段。除了生物大分子之外,还有很多有机分子,特别是药物分子,也有手性的结构,圆二色光谱技术也是研究这些分子结构的重要工具。圆二色光谱仪是一个差吸收光谱仪。圆二色光谱仪的设计和制作则远比吸收光谱仪的设计和制作复杂。首先,圆二色光谱仪的光谱范围宽。很多生物大分子,如蛋白质是无色的。也就是说,这些蛋白质在可见光波段没有吸收,在可见光波段也没有圆二色性。蛋白质分子的手性结构所引起的圆二色性主要在远紫外波段,最小波长到190nm,因此圆二色光谱仪的光谱范围也要能够覆盖这个波段。同样,有些色素分子的圆二色性在近红外波段,因此圆二色光谱仪的波长范围要覆盖190~900nm。为满足这个指标,圆二色光谱仪的光源、光学器件和探测器的技术要求都要比吸收光谱仪高。其次,圆二色光谱仪需要设计专门的起偏器件,这个起偏器件要能够生成左旋圆偏振光和右旋圆偏振光。第三,由于圆二色光谱是差吸收光谱,其信号要比吸收光谱弱很多,这对仪器的检测器和放大器都提出很高的要求。吸收光谱仪一般用光电管作检测器,而在圆二色光谱仪中均用光电倍增管。由于光谱范围的要求,在近红外段,还需要更换对红外光敏感的光电倍增管。在放大器部分,需要采用一定的调制技术来提高信噪比。总之,圆二色光谱仪的设计和制作都远比吸收光谱仪复杂,其仪器的价格也比较昂贵,这也相对限制了圆二色光谱技术的普及和应用。2仪器原理图1是本实验室的JASCOJ-715型偏振光谱仪的原理图。仪器主要由光源、单色仪、起偏器、调制器、光探测器等单元组成。光源采用氙灯。调制器则受一个50kHz的电压信号控制,其光学介质的光学特性也以相同频率变化,输出50kHz交替变化的左、右旋单色圆偏振光。调制器输出的光作为入射光照射在样品上,如果样品在此波长下有圆二色性,那么透射光的光强也随着左、右旋圆偏振光的交替变化而变化。光电倍增管把光强转换为电流,也将变化的光强信号转换为交流信号。这个交流信号的强度就反应了样品在这个波长下的圆二色性的数值大小,用H表示,圆二色数值的单位是椭圆度,在J-715上经常用毫度来表示。改变波长K,测量不同波长处样品的H,就得到样品的圆二色光谱。3圆二色光谱研究蛋白质的二级结构与构象变化圆二色光谱是研究蛋白质二级结构的一个非常重要的工具。蛋白质是由氨基酸分子构成的链状生物大分子。但天然的蛋白质分子并不是以长链分子的状态存在,而是折叠成特定的三维结构。蛋白质的二级结构指的是其主链的构象,有A螺旋,B折叠,B转角和无规卷曲等4种常见的空间形态。蛋白质的圆二色性是其酰胺键(肽键)的相互作用引起的,酰胺键的吸收范围在190~250nm,所以常用这波长范围来测量蛋白质的圆二色谱。蛋白质的二级结构的不同,使得其相邻酰胺键的相互作用不同,表现为不同的圆二色光谱特征。A螺旋形态,由于其手性特征明显,其圆二色信号最强。图2显示了蛋白质的4种二级结构对应的圆二色光谱图。图24圆二色光谱研究有机分子的结构与相互作用4.1色素蛋白中的色素分子相互作用植物中光合作用的蛋白很多是含有叶绿素分子的蛋白,这些叶绿素分子相互作用,形成一个有效的传递光能的网络。色素分子之间的这种激子相互作用,可以诱发出很强的圆二色信号,因此圆二色光谱也成为检测和观察叶绿素分子相互作用的一个有力工具。图3显示的是高等植物光系统II(PSII)的圆二色光谱图以及其随温度的变化。和蛋白质不同,叶绿素分子的吸收在可见光段(400~720nm),所以其圆二色光谱也在可见光段。从图3中可以很明显地看出光系统II的叶绿素激子相互作用网络,随着温度升高而被破坏,通过观察其圆二色信号随温度衰减的过程,可以分辨出两个阶段,分别对应与光系统II外周天线的解体和反应中心的解体。实验用光系统II蛋白的叶绿素浓度为0.1mg/mL,光径为2mm,温度范围25~80e[9,10]。4.2圆二色光谱技术用于药物分析研究近年随着药物开发研究工作的发展,CD逐渐成为药物开发研究中不可缺少的测试手段之一。例如,青蒿素是我国特有的抗虐药,具有扭曲的过氢键结构,运用CD技术可以定量测定它的含量。用CD谱作定量分析时的精度与定量峰的选择有关。同时具有相似生色团的混合物,只要其中一个化合物是非手性的,就可以不必分离、直接进行定量分析,但样品浓度应在线性范围之内。青蒿素在杂质氢化青蒿素和失碳倍半萜内酯存在下测量青蒿素的百分含量时,总浓度控制在2~8mg/mL,溶剂为甲醇,扫描范围:350~200nm,在定波长229nm和260nm下记录CD值。胰岛素的非注射给药一直受到广泛关注,通过舌下给药有很多好处,但渗透系数小。研究者考察了各种渗透促进剂经正常大鼠舌下给药后降血糖的效果,结果显示渗透促进剂影响膜脂的流动性,使蛋白构象趋于松散从而提高黏膜的通透性,促进胰岛素的舌下吸收。CD用样品取舌下黏膜细胞膜团块0.5mg溶于pH值为7.4的PBS0.5mL重新分散,使细胞膜终浓度为0.5mg/mL,扫描范围250~190nm,1mm光径。2荧光分析法1、简介1.1.和UV异同点1)构造与UV很相似.属于分光光度法,光源.单色器等2)组件的布置稍有不同荧光采用激发光和发射光成直角的直角光路.,3)原理也不一样.1.2.荧光分析法主要应用范围与常用方法应用范围：1）生物技术的分析,免疫技术的分析,如DNA、抗体、抗原等;2）痕量元素的分析，如70多种无机元素；3）间接测定众多的有机物，包括药物。常用方法：1.X射线荧光分析（X射线）2.原子荧光分析（激光）3.分子荧光分析（汞弧灯）1.3.优势1）灵敏度高：比UV高2~~3个数量级.2）信息多:激发分光光谱（信息同于UV）、发射光光谱的发光强度、发光寿命、量子效率、荧光偏振等多种信息,定性更好;3）工作曲线的线性范围宽（定量更准）应用范围也广微量元素的分析、医药、环境,石油工业等能直接或间接分析众多的有机物4）专一性强：许多物质的测定采用间接法.2、荧光发光的原理激发和发射过程1.激发过程：①基态：能量最低状态S0②激发态:电子处于反键轨道上为激发态*和n*过程电子激发过程很快，10-15S，不稳定。2.发射过程当激发态在返回基态时，伴有光子的辐射称为发光过程，又称发射过程。荧光和磷光均为此种光致发光过程。(又称冷光)实际从激发态回到基态过程充满竞争。(jablonskii)杰不朗斯基的图解S:基态S*激发态S0、基态F:荧光P:磷光S1:为单一态的低能级T:三重态ThreeVR:振动驰豫VibratoryRelaxation内转换：InterCrossing系内转换：InterSystemCrossing1）单一态激发过程中,当S=0时为单一态.①S原子光谱谱项符号量子数S的2S+1表示谱项的多重性，②自旋量子数ms（电子）可取值只有±1/2（即顺旋或反旋）③自旋的两种状态:当自旋配对时.S=0，不配对则S=12）三重态.S=1则2S+1=3A.B.激发过程中自旋方向被倒转或改变了，则为三重态；C.三重态的能量比相应的单一态高，但能量差要低.应该到三重态.D.单一态向三重态的跃迁属于跃迁禁戒，跃迁几率为单重态向单一态的10-6。3）振动驰豫VibratoryRelaxation溶质分子向溶剂转移过剩的振动能吸收跃迁所需的时间很短(10-15S)，分子具有的几何形状及所处的环境还来不及改变，可能发生两种变化①直接从激发回到基态（发射光子）10-9~10-7S②发射辐射前改变振动能级.10-11~10-13S溶质分子向溶剂转移过剩的振动能而发生的分子驰豫是相当快的，在10-11~10-13S就能无辐射而降落到受激态最低振动能级，因为快，所以溶液中分子快速振动驰豫后，光子发射总是由受激态的最低振动能级发生的。4）荧光Fluorescence分子处于受激态的最低振动能级后，变化之一发射光子回到基态---荧光波长：荧光光谱吸收光谱量子效率φ:受激单一态的寿命在10-9~10-7，若无其他竞争，则全部受激分子发射荧光，φ=1；实际有竞争，0---1之间5）内转换:(IC)InterCrossingA.全部激发能转变为热.而本身回到基态,即受激单一态与基态间转换，为低效率过程;B.受激单一态间(能量不同的单一态)的内转换则为多得多的几率过程.(主要）6）系内转换(ISC)ISC:单一态与三重态间的转换对三重态布居粒子的高效途径是与回到基态发生争夺。状态的改变是禁戒的，但发射光子回到基态需要10-9--10-7S,而内交换只需10-13S,比发射光子的时间更短.所以系内交换可与荧光发射进行竞争。7）磷光phosphorescence受激三重态上的粒子回到单一态基态的形式是被禁戒的.但还是可发生的原因：寿命很长(10-3S)及ΔE小.总结:原理2步①激发λex,②发射λem,发时竞争3、量子效率:(在定量计算先讨论Ф)影响发生的因素总的是内交换.(IC和ISC)。衡量发生的效率如何前已提到，以量子效率Ф来判断；数值在0—1。其公式为公式Ф=xcffkkkkk：为速率常数,竞争由时间的快慢起重要作用,因此以其各影响因素的速率常数体现.Ф=xcffkkkkKf:荧光发生过程Kx:系内交联的ISC过程Kc:第一受激单一态的无辐射能量损失过程或讲将其激发能转变为热能过程的IC过程。KfKc和KxФf-1，Kc或KxKf则Фf-0无荧光Kf大小影响Фf的大小3.影响k的因素:1）Kf为最低受激单一态与基态之间跃迁几率大小的量度。Δεmax(摩尔吸光系数)当εmax变小时.可预期Kf也相应变小；*吸收带的εmax大于n*,大约大10倍.*的Kf远比后者大2）KxISC的几率的大小强烈依赖单一态和三重态之间的能量大小。能量差愈小，则ISC几率大，Kx变大3）Kc受环境因素的影响最为强烈，主要影响是T。∴随T变大碰撞变多，无辐射去激活的几率增大。K