化合物生物矿化的逆同位素标记分析法

化合物生物矿化的逆同位素标记分析法齐孟文中国农业大学评估有机化合物的生物降解是地质与环境科学中的一个常见问题。直接测定有机物降解消耗的方法显然是不够精确的，因此常采用同位素标记的方法。有机物矿化的研究中，通常是用13C标记底物，由直接测定矿化产生的13CO2，以确定有机物的降解过程和程度，然而一般讲有机物标记困难且成本昂贵，沉积物等介质中的溶解有机物则根本无法标记，为此这里提出一种化合物矿化的逆同位素标记分析法。1.基本原理化合物矿化的逆同位素标记分析法的原理是，在分析介质中加入13C-H2CO3标记的溶解的无机碳库（DIC=CO2（aq）+HCO3-+CO32-），则在封闭的培养系统中，有机物降解的终端产物CO2将在气相和液相分配，并稀释标记溶解无机碳库的13C丰度，基于同位素稀释质量平衡原理可以求得矿化所产生的CO2，进而得出有机物矿化过程，这是一种灵敏的、简单的和相对廉价的测定有机物矿化的方法。图.化合物生物矿化的逆同位素标记分析法图.连续流气体测定Gasbench-IRMS系统2.一般流程底物（无碳酸盐）H213CO3+H2CO3(30mM，X13C～10%-55%）厌氧培养磷酸法DIC样品制备CG或gasbenchCG测定过程举例1）培养实验于250ml血清瓶盛装135ml无碳酸盐缓冲的新鲜培养基，上盖并用CO2/N2（20/80，v/v）冲洗，然后将NaH13CO3和NaH12CO3灭菌原液（各1M）由瓶口丁基橡胶塞注入，调节使介质的碳酸盐浓度为30mM，13C的比率为10%-50%，然后注入底物，并接种母体培养基，于300C黑暗中培养。2）样品制备对于GC-IRMS测量，从培养瓶中取出0.5ml的液体样品，立即注入15ml预先盛有4.5ml无水H3PO4（1M）的血清瓶，用丁基橡胶塞密封，氦气或氮气冲刷玻管顶空，加热板加热使利用酸化反应转化DIC成为CO2，在CO2（g）-CO2（aq））平衡后，取部分顶空气体进行测定。DIC的浓度通过测定质量44的峰有标准校正得到，13CDIC由以下计量关系式进行计量。图.酸化样品产生的CO2，用吸附除去CO2的高纯氦气清扫，出口针连接到铜管的开口端侵入水中，以防止大气中CO2倒流进入样品。3）测试系统ThermoFinnigan(不莱梅港市，德国,ThermoFisherScientific)GasBenchⅡ，配置着CTC自动进样器（CTCAnalyticsAG,Zwingen,Switzerland），和ConFloⅣ接口和一个DeltaⅤ质谱仪（也是ThermoFisherScientific）在ETH苏黎世（苏黎世，瑞士）。3.计量关系1）13CDIC测量计量公式经H3PO4酸化的溶解无机碳DIC转化成CO2（g）和CO2（aq），由于CO2在气液两相中分配，因此需将直接测量对象CO2（g）的13C，转变成DIC的13C，即13CDIC。相关计量公式推导如下：（1）式中，Xg和（1-Xg）分别为CO2（g）和CO2（aq）的摩尔分数。aq13gg13gDIC15CX-1CXC）（CO2（g）和CO2（aq）之间的同位素分馏系数定义为（2）由亨利定律CO2（aq）=PCO2（g），有（3）aq13g13DIC13C-CCRTVVNNlgaqCOgCO22）（）（合并以上各式，最后有（4））（RTVV1C-CClgaq-g13g13DIC13式中，是对CO2的亨利方程常数，在绝对温度T=298.15K的纯水系统为3.345×10-4mol.m-3.pa-1，13Cg-aq为1.07‰，在其它情况下依赖于溶液中盐的强度。由上式可见，修正关系还与Vg/Vl的比值以及绝对温度T有关，通常因为缺少和13Cg-aq的数据，以上关系常用溶解无机碳标准溶液进行校正，只要保证样品与标准的Vg/Vl比值、盐的强度和温度相同，则（1+Vg/（VlRT））为常数，同时校正过程也包括了对测定过程可能同位素分馏的校证，虽然其变化幅度与降解过程本身引起的标记同位素变化幅度往往可以忽略不计。•例题：在T=298.15K下，将1mlH2O+0.1mlH2PO4水溶液，注入12ml密封玻璃管，即Vg=10.9ml，Vl=1.1ml，则11.95103.345298.158.31451.110.9RTVVNN4-lgaqCOgCO22）（）（92%11.95111.95Xg8%92%-100%X-100%Xgl）（2）矿化CO2的计量由质量和同位素守恒定律，有（5）（6）式中，CT表示试验结束时系统总的无机碳，CB为初始时的系统的背景总无机碳，CO2为有机化合物矿化所产生的总二氧化氮，x是13C的同位素丰度，角标T、B和P相应系统总的、背景和矿化的。2BTCOCCP2BBTTCOCCxxx又，背景值为初始时所测定的溶解无机碳与顶空气相中的CO2之和。（7）合并以上各式，最终得到有机化合物矿化所产生的总二氧化碳为（8）其中，xp等于13C的自然丰度，为1.1%。）（）（））（（，mol--CCCOPTTBheadspacegasmeasured2xxxxheadspacegasmeasuredBCCC，3）无机碳平衡的计量设培养容器V=250ml，顶空含有20%CO2，即CO2分压0.2atm，对于t=250C，进行DIC平衡及品种的计算，其平衡关系为查表得t=250C时,亨利常数为-23-3222g2COH2HCOHCOHOHCO）（）（atm/molL29.43kH则又设PH=7.3，因为99%H2CO3以CO2（aq）的形式存在，因此）（）（mol/L0.0068029.430.2kPCHCOCO2aq2)1.699(mmol102500.00680n-3COaq2）（mM80.6]CO[]COH[aq2#32）（由有]COH[]HCO][H[k32-31a，mM96.671080.610]HCO[3.73.6-3）（mmol16.99102500.06796n-3HCO-3由最终；]HCO[]CO][H[k-3-232a，0.068mM107.96610]CO[3.73.10-23）（mmol0.01710250100.068n-3-3CO-239.8%nnnn-23-3aq2aq2aq2COHCOCOCOCO）（）（）（f90.8%-3HCOf0.09%-23COf•参考文献1.MonitoringMicrobialMineralizationUsingReverseStableIsotopeLabelingAnalysisbyMid-InfraredLaserSpectroscopy.EnvironmentalScience&Technology,Environ.Sci.Technol.,2017,51(20),pp11876–118832.Improvedmethodforisotopicandquantitativeanalysisofdissolvedinorganiccarboninnaturalwatersamples.RapidCommun.MassSpectrom.2006;20:2243–2251