离子交换层析法

第九章离子交换层析法仪器设备简介离子交换全套装置第九章离子交换层析第一节离子交换层析基本原理第二节离子交换剂的分类与性质第三节离子交换剂与缓冲液的选择第四节离子交换拄层析操作方法第五节离子交换拄层析应用第一节离子交换层析基本原理一、离子交换剂的组成结构及其的特性二、离子交换剂的选择性三、离子交换柱层析原理示意图一、离子交换剂的组成结构及其特性基质电荷基团反离子商品名纤维素—O—CH2——COO-·Na+CM-纤维素纤维素-O-（CH2）2-N+H（C2H5）2·Cl-DEAE-纤维素聚苯乙烯—————SO3-·Na+732阳离子树脂聚苯乙烯——N+（CH2）4·Cl-717阴离子树脂聚苯乙烯磺酸型阳离子交换树脂的制备离子交换树脂的形状结构示意图二、离子交换剂的选择性1、平衡常数2、选择性与离子的电荷及水合离子半径的关系3、离子浓度对选择性的影响4、两性物质的选择性1、平衡常数值反映离子交换剂对不同离子的结合力或选择性，称为选择系数，此外平衡的移动遵循质量作用定律若KBA值＞1，即[RB]＞[RA]，若KBA值＝1，即[RB]＝[RA],若KBA值＜1，即[RB]＜[RA]，RA+B+RB+A+][][][][RARBKBABA时，]][[]][[BRAARBKBAABK2、选择性与离子的电荷及水合离子半径的关系离子交换剂与各种水合离子的结合力是与离子的电荷量成正比，而与水合离子半径的平方成反比。一价离子：Li+＜Na+＜K+＜Rb+＜Cs+二价离子：Mg2+＜Ca2+＜Sr2+＜Ba2+一价阴离子：F-＜Cl-＜Br-＜I-不同价阳离子：Na+＜Ca2+＜Al3+＜Ti4+磺酸基树脂和季胺基树脂对各种离子的相对选择系数阳离子树脂阴离子树脂反离子相对选择系数反离子相对选择系数H+Na+NH4+K+Mn2+Mg2+Fe2+1.01.51.952.52.352.52.55OH-柠檬酸乙酸Cl-HCO-HPO-苯1.02203.2226.05.5500三、离子交换柱层析原理示意图动画按钮第二节离子交换剂的分类及性质一、离子交换剂分类二、离子交换剂性质一、离子交换剂分类1．疏水性2．亲水性(1)阳离子交换剂(2)阴离子交换剂（1）纤维素离子交换剂（2）交联葡聚糖离子交换剂（3）琼脂糖离子交换剂1．疏水性离子交换剂R-SO-3H+Na+===R-SO3Na+H+R-PO（OH）2+Na+===R-POOHONa+H+R-N+（CH3）3OH-+Cl-==R-N+（CH3）3·Cl-+OH-R-N+（CH3）2OH-+H2O==R-N+（CH3）2H·OH-R-N+（CH3）2H·OH-+Cl-=R-N+（CH3）2H·Cl+OH-阴离子交换剂阳离子交换剂2．亲水性离子交换剂磷酸纤维素CM-纤维素DEAE-纤维素CM-交联葡聚糖DEAE-交联葡聚糖CM-SepharoseCL-6B二、离子交换剂性质颜色与形状交联度吸水量或膨胀度交换容量稳定性比重交换容量交换容量:是指离子交换剂与溶液中离子或离子化合物进行交换的能力。(mg／g或mmol／g、mg／ml或mmol／ml)交换容量的测定：强酸型与强碱型测定其解离盐的能力；弱酸型与弱碱型测定其中和酸碱的能力。影响交换容量的因素：筛孔、离子强度、pH值。强酸型阳离子交换介质交换容量的测定法取一定量的离子交换介质，去离子水溶胀，漂洗干净用1mol／L的NaOH处理，去离子水洗至中性，1mol／L的HCl处理，去离子水洗至中性。然后用1mol／L的NaCl洗脱，收集洗脱液，再通过已标定的NaOH滴定洗脱液中的氢离子浓度，计算出吸附氢离子的毫摩尔数量，除以离子交换介质的质量，即可得到交换容量。计算公式如下：）离子交换介质的质量（）（测得的）交换容量（gmmolHgmmol][/强碱型阴离子交换介质交换容量的测定方法取一定量的离子交换介质，去离子水溶胀，漂洗干净，用1mol／L的HCl处理，去离子水洗至中性，1mol／L的NaOH处理，去离子水洗至中性。然后用1mol／L的NaCl洗脱，收集洗脱液，再通过已标定的HCl滴定洗脱液中的氢氧根离子浓度，计算出吸附氢氧根离子的毫摩尔数量，除以离子交换介质的质量即可得到交换容量。计算公式如下：）离子交换介质的质量（）（测得的）交换容量（gmmolOHgmmol][/凝胶或纤维类弱碱型阴离子或弱酸性阳离子交换介质换容量的测定方法取一定量的离子交换介质，漂洗干净，用1mol／L的NaCl处理，去离子水洗至中性，缓冲液平衡，用已知蛋白的浓度样品过柱吸附，直至柱内的介质吸附的量达到饱和。用一定浓度的NaCl或其他的洗脱剂洗脱，收集洗脱液，测定洗脱液中的蛋白质的浓度，按如下计算公式交换容量。））或体积（离子交换介质的质量（）测得的蛋白质质量（）交换容量（mlgmggmmol/第三节离子交换剂与缓冲液的选择一、离子交换剂的选择二、缓冲液的选择一、离子交换剂的选择必须考虑的影响因素1．阴、阳离子交换剂的选择2．强、弱离子交换剂的选择3．不同离子型交换剂的选择4．不同基质离子交换剂的选择必须考虑的因素①要求高度的不溶性和疏松的多孔结构或巨大的表面积，较多的交换基团和稳定的物理化学性质②影响因素对样品生物活性和可溶性的影响pH对交换基团、分离物电荷及电性强弱的影响分子大小及共存物质的影响1．阴、阳离子交换剂的选择参照电泳结果测定pI确定稳定pH范围碱性分子在偏酸性环境中稳定：细胞色素c酸性分子在偏碱性环境中稳定：核酸、HCG离子交换剂的选择图2、强、弱离子交换剂的选择3、不同离子型交换剂的选择选用何种类型离子交换剂?----取决于离子交换剂对诸反离子的结合力。为了提高交换容量，一般应选择结合力较小的反离子。据此，强阳性和强阴性离于交换剂应分别选择H型和OH型；弱酸性和弱碱性离子交换剂应分别选择Na型和Cl型。4．不同基质离子交换剂的选择基质的理化性质目标物质的理化性质溶液的组成及杂质含量二、缓冲液的选择1、缓冲液pH的选择2、缓冲液离子组成的选择3、缓冲液离子强度的选择1、缓冲液pH的选择①要求：起始缓冲液能使样品中有效成分与离子交换剂结合，洗脱液能使有效成分从离子交换剂上解离下来。②PH值与目标物pI的关系（pH=pI±1）③选择性吸附④选用弱阳离子交换剂时，pH高于其pK；选用弱阴离子交换剂时，pH低于其pK；2、缓冲液离子组成的选择①缓冲液离子的pK值要接近所用的pH，②采用阳离子交换剂应选用阴离子缓冲液，如：磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐③采用阴离子交换剂应选用阳离子缓冲液，如：Tris④缓冲液离子不影响被分离物的活性、测定、溶解度。3、缓冲液离子强度的选择①起始缓冲液能使样品中有效成分与离子交换剂结合，一般小于0.1mol/L。②洗脱液能使有效成分从离子交换剂上解离下来，一般0.15mol/L（或采用pH洗脱）。第四节离子交换拄层析操作方式一、离子交换剂的处理、转型和再生二、分离物质的交换三、物质的洗脱与收集一、离子交换剂的处理和转型一般程序：水泡，悬浮，酸或碱浸泡，洗涤至中性疏水性离子交换剂用2-4倍的2mol/LNaOH或2mol/LHCl溶液处理亲水性离子交换剂用0.5mol/LNa0H或0.5mol/LHCl溶液处理；转型与再生：由一种反离子转到另一种反离子的过程。欲使阳离子交换剂转成钠型时，则需用NaOH处理；欲使其转成氢型时，则需用HCl处理；欲使其带铵离子时，则需用NH4OH或NH4C1处理。目的：使离子交换剂带上所希望的离子或基团二、分离物质的交换分批法柱层析法实际交换量只能按理论交换量的25％-50％计算。分批法柱层析系统的组装柱层析系统的连接三、物质的洗脱与收集梯度混合器及形成的梯度变化离子强度梯度洗脱pH值梯度洗脱产生梯度溶液的三种装置及形成的梯度变化C=CB-（CB-CA）（1-V2/V1）B1/A1CA、CB＝梯度混合器A瓶、B瓶的浓度；A1、B1＝A瓶、B瓶的横切面积；V2＝流经层析柱的体积，V1＝梯度洗脱液的总体积。线性和阶梯式梯度溶液分离牛血清白蛋白的图谱第五节离子交换拄层析应用一、去离子水的制备二、制备、纯化生命物质二、测定蛋白质的等电点