2015年版中国药典四部色谱法概况

中国药典2015年版四部色谱法概述郑正合肥市食品药品检验中心合肥市食品药品检验中心BEAConfidential.|2主要内容2015年版药典四部色谱法目录及修订情况色谱法的基本概念色谱法在中国药典中的沿革中国药典2015年版色谱法内容概况合肥市食品药品检验中心2015版四部色谱法目录编号通则名称2010年版二部原附录名称0500色谱法0501纸色谱法VA纸色谱法0502薄层色谱法VB薄层色谱法0511柱色谱法VC柱色谱法0512高效液相色谱法VD高效液相色谱法0513离子色谱法VE气相色谱法0514分子排阻色谱法VF电泳法0521气相色谱法VG毛细管电泳法0531超临界流体色谱法（新增）VH分子排阻色谱法0532临界点色谱法（新增）VJ离子色谱法0541电泳法0542毛细管电泳法合肥市食品药品检验中心BEAConfidential.|4色谱法的基本概念色谱法是利用混合物中各组分的理化性质的差异(吸附力、溶解度、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力等)，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相叫固定相，另一相流过此固定相叫作流动相。由于各组分受流动相作用产生的推力和受固定相作用产生的阻力的不同，使各组分产生不同的移动速度，使得结构上只有微小差异的各组分得到分离。再配合相应的光学、电学、电化学和或其他相关检测手段，对各组分进行定性和定量分析的方法。合肥市食品药品检验中心合肥市食品药品检验中心•毛细管电色谱法（CEC）•色谱法•GSC•液相色谱法（LC）•柱色谱法•平面色谱法•毛细管电泳法（CE）•LLC•LSC•SEC•IEC•BPC•纸色谱法•薄层色谱法（TLC）•LLC•LLC•LSC•气相色谱法（GC）•柱色谱法•GLC•超临界流体色谱法（SFC）色谱法的分类合肥市食品药品检验中心色谱法的基本概念分离原理吸附色谱法分配色谱法离子交换色谱法排阻色谱法分离方法纸色谱法薄层色谱法柱色谱法高效液相色谱法气相色谱法合肥市食品药品检验中心色谱法在中国药典中的沿革纸色谱法(1985)薄层色谱法(1985)柱色谱法(1985)高效液相色谱法(1985)气相色谱法(1985)电泳法(1990)毛细管电泳法(2000)分子排阻色谱法(2000)离子色谱法(2010)超临界流体色谱法（2015）临界点色谱法（2015）合肥市食品药品检验中心0501纸色谱法系以纸为载体，纸上所含水分或其他物质为固定相，用展开剂进行展开的分配色谱鉴别纯度检查含量测定合肥市食品药品检验中心0501纸色谱法二部P1000页合肥市食品药品检验中心0502薄层色谱法薄层色谱法系将供试品溶液点于薄层板上，在展开容器内用展开剂展开，使供试品所含成分分离，所得色谱图与适宜的标准物质按同法所得的色谱图对比，亦可用薄层色谱扫描仪进行扫描，用于鉴别、检査或含量测定将旧版药典“对照物”修订为“对照标准物质”合肥市食品药品检验中心0502薄层色谱法新版药典规范了市售薄层板的要求：市售薄层板按固定相种类分为硅胶薄层板、聚酰胺薄层板、氧化铝薄层板等；按固定相粒径大小分为普通薄层板（10～40um）和高效薄层板（5～10um）；按硅胶板是否含有荧光剂分为硅胶G板和硅胶GF254板。操作方法:点样点直径限值由3mm修改为4mm。其他变化：基本整合旧版药典一部和二部。合肥市食品药品检验中心0502薄层色谱法仪器与材料薄层板点样器展开容器显色剂显色装置检视装置薄层扫描仪合肥市食品药品检验中心0502薄层色谱法操作方法薄层板制备点样展开显色与检视记录合肥市食品药品检验中心0502薄层色谱法操作方法薄层板制备（1）市售薄层板除聚酰胺薄膜外，110℃活化30分钟；如被空气杂质污染，可以用溶剂预洗（2）自制薄层板合肥市食品药品检验中心0502薄层色谱法操作方法点样在洁净干燥的环境中用专用毛细管或配合相应的半自动、自动点样器械点样于薄层板上一般为圆点状或窄细的条带状点样基线距底边10〜15mm，高效板一般基线离底边8〜10mm。圆点状直径一般不大于4mm，高效板一般不大于2mm；条带状宽度一般为5〜10mm，高效板条带宽度一般为4〜8mm。点间距离可视斑点扩散情况以相邻斑点互不干扰为宜，一般不少于8mm，高效板供试品间隔不少于5mm合肥市食品药品检验中心0502薄层色谱法展开示意图高效板上行一般为5～8cm合肥市食品药品检验中心0502薄层色谱法操作方法显示与检视有颜色的物质直接可见光下检视无色物质可用喷雾和浸渍以适宜的显色剂显色，或者加热显色紫外荧光下显色（254nm和365nm）在紫外光下有吸收的成分，可用GF254板（带荧光剂），观察淬灭形成的斑点合肥市食品药品检验中心0502薄层色谱法操作方法记录摄像设备拍摄，记录光学照片或电子图像薄层扫描仪扫描仪扫描或其他方式记录色谱图合肥市食品药品检验中心0502薄层色谱法系统适用试验要求（1）比移值Rf=0.2~0.8合肥市食品药品检验中心0502薄层色谱法系统适用试验要求按各品种项下要求对实验条件进行系统适用性试验，即用供试品和标准物质对实验条件进行试验和调整，应符合规定的要求。合肥市食品药品检验中心Rf=0.2~0.80502薄层色谱法（1）比移值合肥市食品药品检验中心0502薄层色谱法（2）检出限指限量检査或杂质检査时，供试品溶液中被测物质能被检出的最低浓度或量。一般采用已知浓度的供试品溶液或对照标准溶液，与稀释若干倍的自身对照标准溶液在规定的色谱条件下，在同一薄层板上点样、展开、检视，后者显清晰可辨斑点的浓度或量作为检出限。合肥市食品药品检验中心0502薄层色谱法（3）分离度（分离效能）供试品与对照标准物质色谱中斑点均应清晰分离薄层扫描法用于限量检查和含量测定时，R1.0合肥市食品药品检验中心0502薄层色谱法（4）相对标准偏差（薄层扫描要求）同板同供试液（不显色）：RSD≤5.0%同板同供试液（显色）：RSD≤10.0%不同板同供试液（显色和不显色）：RSD≤10.0%合肥市食品药品检验中心0502薄层色谱法测定法•鉴别：供试品与对照标准物质斑点颜色和比移值一•限量检查与杂质检查：半定量•颜色（峰面积）：供试品杂质斑点杂质对照品斑点•颜色（峰面积）：供试品杂质斑点稀释对照液主斑点合肥市食品药品检验中心0502薄层色谱法测定法•薄层扫描法：对照标准物质，两个浓度，每个浓度点样≥2个供试品取样2份，每份点样≥2个对照标准物质和供试品交叉点样基本要求：非显色法，RSD≤5.0%显色法，RSD≤10.0%•除另有规定，含量测定应使用市售薄层板合肥市食品药品检验中心0511柱色谱法吸附柱色谱分配柱色谱合肥市食品药品检验中心高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入柱内，各组分在柱内被分离，并依次进入检测器，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号0512液相色谱法合肥市食品药品检验中心高效液相色谱仪流程图1．贮液罐2．高压泵（输液泵）3．进样装置4．色谱柱——分离5．检测器——分析6．废液出口或组分收集器7．记录装置合肥市食品药品检验中心0512液相色谱法对仪器的一般要求和色谱条件髙效液相色谱仪由髙压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。色谱柱内径一般为3.9〜4.6mm,填充剂粒径为3〜10um。超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2mm)填充剂的耐超髙压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。合肥市食品药品检验中心色谱柱反相(非极性:C18、C8、CN、NH2)(组分的出峰顺序：极性大的先出峰，极性小的后出峰。)正相(极性：硅胶)主要用于分离溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物(极性：固定相流动相)离子交换分子排阻手性分离0512液相色谱法合肥市食品药品检验中心检测器0512液相色谱法检测器是液相色谱仪的“眼睛”其作用是把色谱柱连续流出的样品组分转变成易于测量的电信号，被数据系统接收，得到样品分离的色谱图检测器性能的好坏直接关系到分析结果的可靠性与准确性—通用型检测器（例如：示差折光检测器）—专用型（选择性）检测器（例如：紫外检测器、荧光检测器）—半通用型检测器（例如：蒸发光散射检测器）根据对各类物质响应的差别，检测器可分为三大类：合肥市食品药品检验中心增加了超高效液相色谱柱内径（约2mm或更小），粒径（约2μm或更小）（结果产生争议时，应以品种项下规定的色谱条件的测定结果为准）温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但不宜超过60℃。品种正文项下规定的条件除填充剂类型、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱内径与长度、填充剂粒径、流动相速度、流动相组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等，均可适当改变，以达到系统适用性试验的要求。0512液相色谱法合肥市食品药品检验中心流动相的要求2015版2010版流动相调整比例当小比例组分百分比X≤33%时，允许改变范围为0.7X～1.3X；当小比例组分百分比例X＞33%时，允许改变范围为X±10当小比例组分百分比例X≤50%相对于自身的改变量不超过±30%且相对于总量的改变量不超过±10%为限；如30%的改变量的数值超过总量的10%时，则改变量以总量的±10%为限。0512液相色谱法合肥市食品药品检验中心HPLC：系统适用性要求（通则）中国药典要求对仪器进行适用性试验，即用规定的对照品对仪器进行试验和调整，要求达到规定的要求或满足在分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度、重复性和拖尾因子等相关规定。色谱系统的适用性试验通常包括理论板数、分离度、灵敏度、拖尾因子和重复性等五个参数。按各品种正文项下要求对色谱系统进行适用性试验，即用规定的对照品溶液或系统适用性试验溶液在规定的色谱系统进行试验，必要时，可对色谱系统进行适当调整，以符合要求。0512液相色谱法合肥市食品药品检验中心要求：--理论塔板数N：大于规定值（按规定方法计算，具体品种）--拖尾因子T：应在0.95-1.05之间（以峰高定量时）--分离度R：应大于1.5--重复性：连续进样5次，峰面积的相对标准偏差不大于2.0%--灵敏度：（新增）→定量：10:1；定性：3:10512液相色谱法合肥市食品药品检验中心系统适用性试验（1）色谱柱理论板数（n）具体品种要求不同用于评价色谱柱的分离效能。由于不同物质在同一色谱柱上的色谱行为不同，采用理论板数作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质，一般为待测组分或内标物质的理论板数。在规定的色谱条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分峰或内标物质峰的保留时间tR（以分钟或长度计，下同，但应取相同单位）和峰宽（W）或半高峰宽（Wh/2），按n=16（tR/W）2或n=5.54（tR／Wh∕2）2计算色谱柱的理论板数。0512液相色谱法合肥市食品药品检验中心无论是定性鉴别还是定量分析，均要求待测峰与其他峰、内标峰或特定的杂质对照峰之间有较好的分离度。除另有规定外，待测组分与相邻共存物之间的分离度应大于1.5系统适用性试验（2）分离度（R）21)(212WWttRRR)(70.1)(22/,22/,112hhRRWWttR0512液相色谱法合肥市食品药品检验中心系统适用性试验（3）灵敏度（S/N）定量测定时，信噪比应不小于10；定性测定时，信噪比应不小于3.系统适用性试验中可以设置灵敏度测试溶液来评价色谱系统的检测能力。0512液相色谱法合肥市食品药品检验中心系统适用性试验（4）拖尾因子（T）以峰高作定量参数时，除另有规定外，T值应在0.95~1.05之间。0512液相色谱法105.02dWTh合肥市食品药品检验中心（5）重复性用于评价色谱系统连续进样时响应值得重复性能。采用外标法时，通常取各品种项下的对照品溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面积测量值得相对标准