多克隆抗体制备―Elisa

免疫学实验·1·多克隆抗体的制备周艳张海红E-mail：[e-mail]-mail：[e-mail]免疫学实验·2·试剂:抗原：OVA（卵清蛋白）抗体：一级抗体：小鼠血清二级抗体：HRP-Ab封闭液：1%BSA包被缓冲液抗体稀释液：PBS洗液：PBST底物溶液：OPD终止液：2M硫酸弗氏完全佐剂弗氏不完全佐剂器材:96孔板加样器(一套）加样器头（一套）吸水纸（若干）酶标仪（一台）实验器材及物品分配免疫学实验·3·主要操作步骤一、免疫小鼠二、制备血清三、用Elisa法检测血清中抗体的效价免疫学实验·4·免疫方式肌肉注射（intramuscularinjection，i.m.）腹腔注射（intraperitonealinjection，i.p.）皮下注射（subcutaneousinjection，s.c.）静脉注射（intravenousinjection，i.v.）抗原：OVA7天免疫一次，共三次免疫佐剂弗氏佐剂(Immunoadjuvant)•完全弗氏佐剂（石蜡油+羊毛脂+卡介苗）•不完全弗氏佐剂（石蜡油+羊毛脂）细胞因子•IL-2、IL-1、IFN-γ、IL-12、GM-CSF免疫小鼠免疫学实验·5·摘取小鼠眼球，用1.5mlEP管接血。4000rpm，离心10分钟，吸取上清（血清）待用。拉颈处死小鼠。制备血清免疫学实验·6·酶联免疫吸附（enzyme-linkedimmunosorbentassay，Elisa）利用抗原抗体反应的高度特异性和酶对底物高效催化性，将抗原或抗体吸附于固相载体表面，通过底物的显色反应鉴定抗原抗体结合的反应免疫小鼠血清抗体效价测定免疫学实验·7·Elisa酶联免疫吸附（enzyme-linkedimmunosorbentassay，Elisa）利用抗原抗体反应的高度特异性和酶对底物高效催化性，将抗原或抗体吸附于固相载体表面，通过底物的显色反应鉴定抗原抗体结合的反应免疫学实验·14·ELISA的应用ELISA是目前应用最广泛的免疫学检测技术之一，常用来测量机体的可溶性的抗原或抗体。由于它敏感性高，可测微量的的抗体或激素、细胞因子及粘附分子等抗原性物质。成品的试剂盒，已广泛用于临床某些疾病的诊断。免疫学实验·15·ELISA分类直接法——一抗带酶间接法——二抗带酶双抗夹心法——检测抗原直接夹心法间接夹心法检测抗体免疫学实验·16·直接法免疫学实验·17·1.Antigenispassivelyabsorbedtosolidphasebyincubation2.Antibodiesareaddedandincubatedwithsolid-phaseattachedantigen.ThosewhicharespecificwillbindtoantigenExcessantibodiesornon-bindingcomponentsarewashedawayafterincubationphase3.Antibodieslabeledwithenzyme(conjµgate)directedagainsttheparticµLarspeciesinwhichtheoriginalantibodieswereproduced(anti-species).4.Thesebindtoanyantibodieswhichareattachedtoantigen.Excessconjµganteiswashedawayafteraperiodofincubation5.Substrate/chromophoreisaddedandcolordevelopsasaresµLtofenzymepresent.Afteraperiodofincubationofthecolourdevelopmentisptoppedandreadbyspectrophotometer间接法免疫学实验·18·直接夹心法免疫学实验·19·间接夹心法免疫学实验·20·包被:OVA抗原(50ug/ml)100µL/孔,4℃过夜.封闭：弃上清,加入封闭液150µL/孔,37℃，40min.洗涤:加洗液200ul/孔，洗涤三次,每次3分钟.一抗:弃上清,加入不同稀释度的待测血清抗体100µL/孔37℃，40min.洗涤:加洗液200ul/孔，3分钟,弃上清，再重复两次酶标抗体:加入HRP标二抗100µL/孔37℃40min.洗涤:洗涤三次,每次3分钟显色:加入底物100µL/孔，避光15min加终止液:加2M硫酸50µL/孔测量:酶标仪测定OD490nm值.实验步骤免疫学实验·21·抗体的倍比稀释1/2001/4001/8001/16001/32001/64001/128005µL抗体(血清)500µL抗体稀释液(PBS)500µL500µL500µL500µL500µL500µL1234567995µL抗体稀释液（PBS）加佐剂组和不加佐剂组血清各做一套上述稀释度免疫学实验·22·每组一块96孔板，每个样三个复孔，纵向排列。加样如下：1-7:不同稀释度的抗体，依次为1/200，1/400，1/800，1/1600，1/3200，1/6400，1/12800；8：阴性对照孔。加板方法123456789101112ABCDEFGH加佐剂组不加佐剂组免疫学实验·23·抗体效价:1.出现颜色变化的抗体最高稀释倍数（目测）2.二倍于阴性对照OD值(酶标仪）结果判定免疫学实验·24·结果分析—写在记录本上1观察实验现象：从加底物到终止反映是的颜色变化，及各个稀释度之间的颜色差异。2判定出加佐剂组和不加佐剂组的抗体效价（二倍于阴性对照OD值）。3用Excel处理数据，作图，横坐标为抗体的稀释度，纵坐标为OD490的数值。4将用Excel图表和原始数据（每人一份）贴到实验记录本上。免疫学实验·25·Excel作图Elisa测定抗体效价00.20.40.60.811.21.41.61.8220040080016003200640012800抗体稀释倍数OD490加佐剂组不加佐剂组