亲和层析

亲和层析AffinityChromatography一、概述亲和层析：是利用生物大分子之间有专一的亲和力而达到分离纯化的层析方法优点：1.纯化过程简单、迅速2.分离效率高3.实验条件温和缺点：1.针对某一分离对象就需要制备专一的吸附剂和建立相应的实验条件2.配基的选择及其与基质的共价结合需要烦琐的操作步骤二、基本原理生物专一吸附(bioselectiveadsorption)1.具有专一性亲和力的生物分子对：酶—底物（包括酶的竞争性抑制剂和辅酶因子）特异性抗原—抗体激素—受体DNA—互补的DNA或RNA凝集素和糖蛋白2.基本过程：固相化(Immobilise)配基Ligand:亲和层析中能被某一生物大分子识别和可逆结合的生物专一性物质。基质Matrix(载体):亲和层析中与配基共价结合,使其固相化的物质。吸附(Adsorption)解吸(Elution)三、载体的选择应具备的特性：1.有丰富的可供活化的化学基团，并在温和条件下能与配基共价结合。2.惰性的，非专一性吸附无或足够小。3.多孔网状结构。4.良好的机械性能，具有好的液体流动性。5.有较好的物理和化学稳定性。可供选择的载体琼脂糖商品名：Sepharose型号：2B，4B，6B型号含义：琼脂糖浓度为2%，4%，6%特点：亲水性强，理化性质稳定，网孔大，非专一性吸附小，只能以湿态保存，经不起有机溶剂处理。聚丙烯酰胺凝胶商品名：Bio-Gelp型号：P-100至-300型号含义：排阻限度，X1000相当于允许进入凝胶内部蛋白质的最大分子量特点：干胶，理化性质稳定,抗微生物侵袭能力较大,适用于配基和亲和物之间亲和力比较弱的系统,应避免在pH2-11以外的溶液中长期使用.葡聚糖凝胶商品名:Sephadex型号:G-100,150,200型号含义:每克干凝胶吸水量X10特点:理化性质稳定,耐热耐碱不耐酸,网孔小四、配基的选择应具备的特性：1.对于欲纯化的生物物质应具有专一亲和性2.必须具备能被修饰的功能基团以酶和底物为例来讨论配基与欲纯化的生物物质的亲和性:KLE+L↔EL在亲和层析中,定义分配系数Kd为:Kd=结合酶/游离酶=[EL]/[E0-EL]=[L0]/KL常数KL越小,配基对大分子的亲和力越高,在亲和层析中就越有价值。配基可以是小分子物质：一些辅酶、辅基大分子物质：酶、抗体纯化酶的配基:底物、酶活性中心、抑制剂、辅酶、辅基等；纯化抗原抗体的配基：互为配基纯化核酸的配基：DNA和RNA，蛋白质和mRNA五、配基的固相化固相化技术：将配基以共价键连接于不溶于水的固相基质上制成固相化吸附剂过程：活化、接臂插入剂或手臂使小分子配基适当的离开载体骨架,克服载体空间位阻的影响六、亲和层析分离（一）装柱和平衡（二）上样、亲和吸附（三）洗脱1.洗脱后可能出现的洗脱图谱酶与杂质一起流出酶与杂质没有完全分离酶与杂质完全分开2.洗脱方法非特异性洗脱:改变缓冲液的pH、离子强度、介电常数或温度使物质构象改变，浓缩、洗脱后立即中和稀释或透析，使蛋白质迅速恢复到天然结构特异性洗脱：再次利用生物学特异性只洗脱和配基专一作用的酶，不洗脱由于非专一吸附上去的杂蛋白（四）再生亲和层析拄可在一次层析后用大量洗脱剂连续洗涤，然后再用平衡缓冲液平衡，经处理后的层析柱能再次使用。七、亲和层析的应用1.分离和纯化2.分辨化学或遗传学上修饰的酶3.纯化亲和标记的活性中心肽段和蛋白质结构研究4.纯化人工合成的多肽和蛋白质5.解释酶作用机理Figure1.Loadingaffinitycolumn.Figure2.Proteinssievethroughmatrixofaffinitybeads.Figure3.Proteinsinteractwithaffinityligandwithsomebindinglooselyandotherstightly.Figure4.Washoffproteinsthatdonotbind.Figure5.Washoffproteinsthatbindloosely.Figure6.Eluteproteinsthatbindtightlytoligandandcollectpurifiedproteinofinterest.亲和层析法分离豌豆凝集素[原理]亲和层析技术利用豌豆凝集素可与葡聚糖凝胶发生特异性结合，再用含葡萄糖的氯化钠溶液将豌豆凝集素洗脱下来。比较豌豆凝集素和杂蛋白对兔红细胞凝集作用的差异来进行鉴定。[器材]1.层析柱2.恒温孵育箱3.反应板[试剂]1.1mol/LNaCl洗脱液2.0.2mol/L葡萄糖NaCl洗脱液3.SephadexG-504.兔红细胞悬液5.样品液：杂蛋白和凝集素[操作]1.亲和层析分离SephadexG-50装柱，用1mol/LNaCl洗脱液平衡5分钟,加样6滴。（方法同凝胶层析）加样后立即开始收集洗脱液，每管收集3ml，控制流速10~15滴/分钟，待杂蛋白洗脱后，开始换0.2mol/L葡萄糖NaCl洗脱液进行洗脱，每管收集3ml。收集约10管后，用1mol/LNaCl洗脱液平衡柱5分钟，此柱即可再生。2.豌豆素生物活性测定取反应板一块，分别在各孔中加入对照生理盐水、杂蛋白洗脱液、豌豆凝集素收集液各二滴再加入兔红细胞悬液1滴，置37℃保温10分钟，取出后用玻棒在反应孔轻轻搅动，比较各孔凝集情况，并解释结果。