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36项目编号大理学院大学生科研基金项目申请书项目名称大理花甸坝饮用水源中大肠菌群的检测申请者张发指导教师杨晓燕(博士)所属学院农学与生物科学学院联系电话18760954816完成时间2014年6月大理学院科技处2013年制填表说明一、申请书请用A3纸双面复印，中缝装订，一式二份，从第二项至第四项，各栏空格不够时，请自行加页。封面上“申请者”只能填写一人。二、部分栏目填写要求：项目类别——在“自然科学研究”和“人文、社会科学研究”中选择一项填写。项目名称——应确切反映研究内容，不得超过25个汉字。开始时间——填“2013年7月”。完成时间——必须于2014年6月30日以前完成。课题组成员——在项目组内起主要作用的人员，包含申请者，最少四名，最多六名。三、经费预算表中，经费的用途及计算依据一栏，请详细列出。四、项目申请书经校属学院签署具体意见、加盖公章、院长签字后，一式二份由各学院统一报送科技处科研管理科，不接受学生个人报送的材料。一、基本情况申请人基本情况姓名性别学号所属学院、专业、入学年份张发男2011112127农学与生物科学学院,生物科学,2011年项目名称大理花甸坝饮用水源中大肠菌群的检测申请经费1000元注：项目经费不得列支指导教师酬金、餐费及人员费。开始时间2013年7月完成时间2014年6月课题组成员签字姓名性别学号所属学院所属专业本人签名张发男2011112127农生学院生物科学陈岗男2011112158农生学院生物科学李志学男2011112135农生学院生物科学张金龙男2011112137农生学院生物科学吴富涛男2011112130农生学院生物科学项目研究内容概述（概述目的、意义、主要研究内容，500个字以内）。大理花甸坝是苍山顶上一块美丽富绕的盆地，由于其风景秀丽，同时具有极丰富的生物多样性，近几年以来已经成为很多旅游达人的目的地，同时也是大理学院重要的学生野外实习基地。本项目拟采用多管发酵法对花甸坝不同饮用水源中大肠菌群进行检测。检测结果可为花甸坝饮用水源的选择及保护提供参考。二、立项依据及项目的创新点大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃24h能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌[1]。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等[2]。大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因[3]。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示水中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小[4]。简单地说，大肠杆菌只是一种菌类，而大肠菌群是一类细菌。据相关资料显示，用大肠菌群作为水质的指示菌的原因有：①在人粪中大量存在，因此在被人粪所污染的水体中容易测到；②检验方法比较简便；③对氯的抵抗力相似于致病的肠道细菌[5]。群数目的表示方法，一般指一升水样中能检出的大肠菌群数。我国地面水环境质量标准（GB3838-83）规定第一级地面水大肠菌群≤500个/L，第二级≤10000个/L，第三级≤50000个/L。我国生活饮用水质标准（GB5749-85）规定生活饮用水大肠菌群为100个/L[6-9]。云南大理风景区花甸坝，是苍山顶上一块美丽富绕的盆地，坐落在云弄、苍酿两峰之后，海拔二千九百公尺，南北长二十多公里，东西宽约三公里。花甸坝由大、小花甸组成，坐落在苍山十九峰中最北的云农、沧浪两峰之间。大花甸海拔2900米，南北长10余公里，东西宽约1公里。坝子西面的的山峰峰顶终年白雪皑皑，经夏不消，40条大大小小的溪水汇集成万花溪，是坝子内的主要水源。东面小花甸群峰环报，海拔3200米，是绿草如茵的台地。整个花甸地势平坦，土质肥沃。奇花异草争奇夺艳，每到春夏之间，漫山遍野都是马樱花，纵横20多里，汇成花的海洋，成为花的世界。花中间杂这白豆花、芍药花等草本花卉，五彩缤纷，瑰丽迷人。因此，最近几年到花甸坝旅游的人越来越多，同时花甸坝也是大理学院最重要的学生野外实习基地。为了保证到花甸坝饮用水的安全，本项目拟采用多管发酵法对花甸坝不同饮用水源中大肠菌群进行检测。检测结果可为饮用水源的选择和保护提供参考。主要参考文献[1]印士勇.水的细菌学检验综述[J].水系污染与保护，1997，1：64-72.[2]赵菊香.水质细菌学快速检测方法简介[J].资源保护，1999，3，24-35.[3]韩文.浅谈大肠菌群及其检验[J].航空航天医药，2009，8：95-95.[4]张济龙，何吉明，何敏.水中粪大肠菌群检测方法及其研究进展[J].青海环境，2012.2:89-92.[5]赵凌宇，沈立峰.粪大肠菌群快速测定法在城市地表水监测中的应用[J].污染防治技术，2007，3:88-89.[6]李贵宝，郝红，张燕.我国水环境质量标准的发展[J].中国标准导报，2003，05：98-101.[7]李勤.新老国标菌落总数大肠菌群测定实验的对比探讨[J].食品与发酵科技，2010，6:69-71.[8]邓钦光，刘志德.公共用具大肠菌群测定中采样方法的探索[J].公共卫生与预防医学，2009，6:65-66.[9]赵金锁.大肠菌群评价饮用水卫生安全的探讨[J].浙江预防医学，2009，8：37-38.三、实施方案、技术关键和预期目标成果实验方案：多试管发酵法检测大理花甸坝饮用水源大肠菌群。1．水样采集采用无菌容器采集各水源地水样，标明水样采集时间、地点。水样采集后应置4℃冰箱中保存。2．培养基及染色剂的配置2.1乳糖蛋白胨培养基的配置：将10g蛋白胨、3g牛肉膏、5g乳糖和5g氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水中，调节溶液pH为7.2-7.4。再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于试管中（内置杜氏小管）,于121℃高压锅内灭菌15min，储存于冷暗处使用。2.23倍浓度乳糖蛋白胨培养基：按上述乳糖蛋白胨培养基的配置方法，除蒸馏水外，各组分用量增至三倍。2.3伊红美蓝培养基：于2000mL烧杯中，先加入20到30g琼脂加到900ml蒸馏水中，加热溶解。再加入2g磷酸二氢钾及10g蛋白胨，混合溶解，用蒸馏水补至1000mL，调节pH到7.2-7.4。再加入10g乳糖，加入2%伊红水溶液和0.5%的美蓝水溶液后于121℃高压锅内灭菌15min，倒平板，储存于冷暗处使用。2.4革兰氏染色剂（1）结晶紫染色剂：将20mL结晶紫乙醇饱和溶液和80mL1%的草酸铵溶液混合、过滤。（2）助染剂：将1g碘与2g碘化钾混合加入少许蒸馏水振荡，待完全溶解后用蒸馏水补至300mL。（3）脱色剂：95%乙醇。（4）复染剂：将0.25g沙黄加到10mL95%乙醇中，待完全溶解，加90mL蒸馏水。3.水样稀释及初发酵试验于各装有5mL三倍浓度乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入1mL水样；于各装有10mL乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内置倒管），分别加入1mL1:10稀释的水样;再于各装有10mL乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内置倒管），分别加入1mL1：100稀释的水样。共计十五管，三个稀释度。将各管充分混匀，置于37℃恒温箱内培养24h。4.平板分离上述发酵管经培养24h后，将产气、产酸及只产酸的发酵管分别接种于伊红美蓝培养基上，置于37℃恒温箱内培养24h，挑选符合下列特征的菌落：深紫黑色，具有金属光泽的菌落：紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落：淡紫红色，中心色较深的菌落[13，14]。取上述特征的群落进行革兰氏染色（步骤如下）：1)用以培养24h的培养物进行涂片，涂层要薄；2)将涂片在火焰上加温固定，待冷却后滴加结晶紫溶液，1min后用水洗去；3)滴加助色剂1min，后用水洗去；4)滴加脱色剂，摇动玻片，直至无紫色脱落为止（约20-30s），用水洗去；5)滴加复染剂，1min后用水洗去，晾干、镜检，呈紫色者为革兰氏阳性菌，呈红色者为革兰氏阴性菌。5.复发酵试验上述图片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑选该菌落的另一部分接种于装有普通浓度蛋白胨培养液的试管中（内置倒管），每管可接种分离自同一初发酵管的最典型菌落1-3个，然后置于37℃恒温箱中培养24h，有产气、产酸者即证实有大肠菌群存在。6.数据统计分析将所采集的八种水样分别按照以上步骤进行检测。通过实验，统计各个水样复发酵后所得的阳性试管数。（1）初步发酵试验水样接种于发酵管内，37℃下培养，24h内小套管中气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果（2）平板分离（3）复发酵试验以上大肠菌群阳性菌落，经过涂片染色为G-无芽孢杆菌者，通过此试验再进一步证实。原理与初发酵试验相同，经24h培养产酸又产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。技术路线：水样采集→初发酵→平板培养→复发酵→数据分析→实验结果技术关键：（1）初步发酵（2）平板培养预期成果:完成大理花甸坝各饮用水源大肠菌群的检测，撰写科研论文1篇，争取在学术刊物发表。四、指导教师意见对创新性、实用性、可行性等做出评价农学与生物科学学院已经具备完成相关该项目所需的实验仪器和设备，本项目申请人及课题组成员长期跟随学院相关老师进行相关科研，并已完成对洱海各入海口中大肠菌群的检测，能够熟练应用相关的研究技术和方法。指导教师签字：年月日五、校属学院意见学院是否同意推荐。校属学院公章校属学院院长签字：年月日六、评审结果年月日