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代谢工程生产抗疟疾药物前体--青蒿酸NO.1第一组组长：曹慧珍、陈亚萍主讲：周汉昌组员：周汉昌、曹慧珍、陈茂盛、陈亚萍、程业久、甘益军、高兆梁工作安排姓名具体工作周汉昌PPT演讲曹慧珍PPT制作，文献收集陈茂盛资料收集陈亚萍PPT制作，文献收集程业久资料收集甘益军资料收集高兆梁资料收集代谢工程青蒿酸、青蒿素合成流程青蒿素提纯总结与展望目录建立在重组DNA技术基础之上的代谢工程技术，是一种在理解细胞代谢功能的基础上，有目的地设计和改造生物体中已有的代谢网络和表达调控网络，从而实现更高效的生物化学转化、能量转移及大分子装配过程的技术。代谢工程技术能够有效地克服传统育种手段的突变非定向性和设计非理性的缺点，自诞生以来，在改造植物、动物、微生物的代谢功能方面得到了广泛的应用。代谢工程Metabolicengineering一种由我国学者在20世纪70年代初从ArtemisiaannuaL（菊科植物，俗称青蒿）中提炼出来的倍半萜内酯环内过氧化物（C-15倍半萜），通过释放高剂量的自由基杀死隐藏于红细胞中的恶性疟原虫。是目前世界上最有效的治疗脑型疟疾和抗氯喹恶性疟疾的药物，被世界卫生组织称为治疗疟疾的最大希望。青蒿素、青蒿酸人工合成青蒿素由于其工艺复杂、毒副作用大、成本高而不能投入生产。世界上青蒿素药物的生产主要依靠我国从野生和栽培青蒿中直接提取。但是青蒿中青蒿素的含量很低(0.1%-1%w/w),且受地域性种植影响较大。目前使用青蒿素进行治疗每个疗程的费用是８美元到１５美元，对于受疟疾危害最深的非洲和南美地区的贫困患者来说过于昂贵。青蒿素、青蒿酸酵母的生长代谢速率较青蒿要高出很多倍，而且其培养条件容易控制，不受气候、政治等因素的影响。因此，如果能用酵母生产青蒿酸，那将是非常高产、高效的。青蒿素、青蒿酸基于这些因素，科学家们开始尝试利用代谢工程手段通过微生物去合成这种物质。这项工作被专门列为“青蒿素计划”，由美国加利福尼亚大学伯克利分校的生化工程师JayKeasling主持，并且起初就获得“比尔-梅琳达盖茨基金会”4260万美元的资助。2006年，Keasling等宣布，通过合成生物学技术对一株酵母菌成功进行遗传工程改造，使得后者可以产生高水平的青蒿酸（artemisinicacid）——青蒿素的一种直接的前体。该成果发表于2006年4月13日英国《自然》杂志上，题为“Productionoftheantimalarialdrugprecursorartemisinicacidinengineeredyeast”青蒿素、青蒿酸焦磷酸法呢酯（FPP）amorphadiene（合成青蒿酸及青蒿素的最直接的前体原料）青蒿酸青蒿素青蒿素、青蒿酸研究人员已经探明青蒿素是通过以下途径在青蒿细胞内合成的：青蒿素、青蒿酸由于酵母也可以合成FPP，所以我们所需要做的只是将FPP到青蒿酸前体（amorphadiene）、青蒿酸前体到青蒿酸这两个过程克隆进入酵母细胞内，并对细胞内的其他与之相关的基因进行调控，使之能正常并且大量合成青蒿酸为了将流程图转为现实，对酵母细胞进行了总共8次的基因工程改造。具体流程可分为两步：一、FPP到青蒿酸前体二、青蒿酸前体到青蒿酸第一步，为了能让酵母细胞合成青蒿酸前体，我们将ADS基因插入由GAL1启动子控制转录的pRS425质粒中，然后在酵母细胞中表达，结果显示单独转入ADS基因的酵母只合成少量的青蒿酸前体。如图中菌株EPY201，4.4mg/L。而细胞中与青蒿酸前体的量最直接相关的就是FPP的量，所以，为了提高啤酒酵母合成青蒿酸前体的能力，我们对FPP合成途径（甲羟戊酸合成途径）进行了总共5次的基因工程改造。几个与FPP合成相关的基因的表达被正调控，而另外几个促使FPP转变成固醇的基因被负调控。同时为了保证宿主菌株的遗传稳定性，所有这些对宿主细胞进行的修饰都是通过染色体融合进行的。具体过程如下：①②③④⑤首先，将一种截短的水溶性酶3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A还原酶（简称HMGCoA还原酶，又简称tHMGR，是固醇合成的限速酶）过表达，可提高青蒿酸前体的合成产量近五倍（菌株EPY208）；其次，利用一个methioninerepressible启动子(PMET3)，通过对编码鲨稀合酶（固醇生物合成途径中FPP合成后第一步）的ERG9基因进行负调控，可将amorphadiene的合成量再增加两倍（菌株EPY225）；然后，尽管upc2-1,一个可以加强UPC２（啤酒酵母中调节固醇合成的一个的通用转录因子）活性的半显性突变体等位基因，在已有菌株EPY208背景下过表达（菌株EPY210）对青蒿酸前体合成的提高起的作用并不显著，但结合对ERG9基因的负调控，其过表达可将青蒿酸前体的合成量提高到105mg/L（菌株EPY213）；再次，在酵母染色体更远处在转进一个tHMGR拷贝可以将将其合成量再增加50%达到149mg/L（菌株EPY219）；最后，虽然编码FPP合酶的基因（ERG20）过表达对青蒿酸前体合成总量（菌株EPY224）的提高效果非常小，但在细胞密度降低的情况下其合成量却可增加10%。将所有这些对基因的修饰综合在菌株EPY224上，青蒿酸前体的合成量已经达到了153mg/L,是之前所报道这种倍半萜(烯)最大合成水平的几乎500倍。现在我们已经得到了可以高效合成青蒿酸前体的酵母菌株，但为能将青蒿酸前体转变成青蒿酸，我们还需要找到并分离出青蒿中编码催化青蒿酸前体转变成青蒿酸的酶的基因。据报道，知道是一种特异的细胞色素P450酶对青蒿酸前体进行专一性羟化，并通过数据库检索得到细胞色素P450已表达序列标志（ESTs），而且已拥有针对CYP71和CYP82家族（P450酶在菊科植物中最多的两个家族，其序列已知）高度特异的简并引物。接下来就是通过对以上条件的运用得到青蒿中这种特异的细胞色素P450基因。步骤如下：高度特异的简并引物青蒿毛状体细胞的互补DNA库＋PCR、凝胶电泳回收等几个特定的p450片段一个青蒿P450基因片段与之对应的mRNA完整P450cDNA（CYP71AV1）RT-PCR转录BLAST分析法将这些片段与向日葵和莴苣的ESTｓ比对，发现有一个青蒿P450基因片段与来自检索所得ESTs序列非常相似经过以上步骤，相应的完整P450cDNA（CYP71AV1），一个编码495个氨基酸的开放阅读框，成功从青蒿中分离获得。为了保证异源表达的CYP71AV1可以发挥正常功能，协同它进行氧化还原反应的天然配体，NADPH：细胞色素P450氧化还原酶（CPR），同样从青蒿中成功分离，并且其生化活性已经在体外被证实。经证明，体外实验中重组的CYP71AV1能将amorpha-4,11-diene高效转化为青蒿酸，完全显示出膜结合、多功能的CYP71AV1是青蒿素的生物合成中的关键促成因素。提纯通过用碱性缓冲液（pH为9的Tris-HCL缓冲液中添加1.2M的山梨醇）清洗胞体沉淀物，绝大部分合成的青蒿酸（96%）可以而被分离出，而且冲洗之后细胞体和培养基中的残留量仅为2%。青蒿酸不仅可以被高效的转移到细胞外，且在酸性条件下经过质子化后会被束缚在细胞表面。利用这个特点制定了一种便捷提纯方法：混合培养物细胞体沉淀物凝胶柱层析碱性清洗缓冲液纯度大于95%的青蒿酸HCL调pH醚抽提抽提产物提纯提纯经检测，可以确定所得到的这株转基因酵母在发酵罐中能够直接合成结构功能上完全正确的青蒿酸且转基因酵母菌株的单位生产效率比青蒿高了近两个数量级。总的来说，采用改造FPP生物合成途径的方法获得了能高水平生产青蒿酸的啤酒酵母菌株。该方法通过表达青蒿酸前体合成酶,一种新型的细胞色素P450和与之相关的来自青蒿的氧化还原酶来提高FPP的产量。据了解，相关转化青蒿酸到青蒿素或其他派生物的化学方法可能还有许多待改进之处，但微生物法生产青蒿酸是获得此类高效抗疟疾药物切实可行的方法。尽管这种代谢工程酵母合成青蒿酸的能力相对于青蒿来说已经十分显著，仍需急切解决问题的是如何提高其生产效率从而扩大至工业规模生产，以便可以生产出足够多的青蒿酸来降低现有青蒿素的价格，让青蒿素综合疗法可以广泛地被应用到对疟疾的治疗中去。代谢工程展望从20世纪70年代开始兴起，代谢工程至今已有30年的发展历史，无论是理论上还是应用上都得到了长足的进步。代谢工程作为一种有目的、有理性的代谢改造技术，应用前景十分广阔，它在医药、环境、发酵工业等方面已有许多成功的实例。随着分子生物学、细胞生物学、生理学等生物学科不断发展，以及化学工程、数学理论及分析检测和信息控制技术等外源学科的发展大大推动了代谢工程的发展。特别是基因识别、基因扩增、基因分离及基因功能分析技术的逐步发展，使代谢工程有目的、有理性的改造更加可行和应用自如。总之，代谢工程作为一门全新的技术，与生物学科及多门交叉学科息息相关。随着该理论的不断完善，其应用必将越来越广泛。LOGONO.1细胞色素P450酶细胞色素P450同工酶是血红蛋白超级家族，它是内质网膜上混合功能氧化酶系统的末端氧化酶。每个细胞色素P450同工酶由一个蛋白质及一个血红素基弥补部分组成。细胞色素P450酶系统催可催化很多反应，包括环氧化反应，N-去烷基化，O-去烷基化，S-氧化及脂肪族和芳香族残基的羟化反应。和所有的酶一样，细胞色素P450同工酶呈饱和Michaelos-Meuten动力学，其活性需要辅助因子，并可被诱导或抑制。系统命名：比如，CYP2家族有几个亚家族，诸如CYP2C、CYP2D、CYP2E。数字代表不同的酶，如CYP2D6，基因同样用CYP2D6表示。不论其来源或催化活性为何，这种命名法的优点是很易识别结构一致或高度相似的细胞色素P450酶。（CYP71AV1）已表达序列标志（EST）EST是从一个随机选择的cDNA克隆进行5’端和3’端单一次测序获得的短的cDNA部分序列,代表一个完整基因的一小部分,EST来源于一定环境下一个组织总mRNA所构建的cDNA文库。EST标记在亲缘关系较远的物种间比较基因组连锁图和比较质量性状信息是特别有用。EST是在随机选择并经序列分析后分离得到的和（或）进行了特性鉴定的核酸，当确定EST片段的序列时尚不知道由之编码的蛋白质的功能。鉴定EST分子：首先确定部分序列信息并将其储存在数据库中；然后用该序列信息作为探针与数据库中的已知序列数据进行比较。在有些情况下，经过这种同源性检索可以在核苷酸序列水平上揭示出与编码已知功能蛋白质的另一种核酸相关的特定EST序列。最后，选择这样的EST分子并进一步分析之。代谢工程青蒿酸、青蒿素合成流程青蒿素提纯总结与展望目录