(III)血细胞分析的质量控制

血细胞分析的质量控制四川省人民医院检验科蹇启政只要在工作中树立全面质量管理意识，采用多种方法作好血细胞分析仪的质量控制，就能发出一分合格的检验结果，也才能在室间质评中取得好的成绩！室内质量控制和校准是全面质量管理中的一个重要环节，是保证实验结果准确的重要措施。一、概述从1949年美国CollegeofAmericanPathologists（简称CAP）首先开始研究临床实验室室内质量控制（简称质控）问题，美国学者Levery和Jenning于1950年发表第一篇关于使用质控图的实验室室内质控，临床检验实验室的室内质控工作正式拉开序幕。到70年代，实验室质量控制进入一个新的阶段-全面质量管理，推行GoodLaboratoryParctice（简称GLP）。进人80年代末期，GLP的统一标准产生了，发展到“认证实验室”管理阶段。全面质量管理的宗旨在于预防差错的产生。质控图的统计学质控的目的是检出差错。统计学的实验室室内质控是全面质量管理中的一个重要环节。1．基本概念1．1质量控制（QuailityContro，Q.C）质量控制是监视全过程，排除误差，防止变化，维持标准化现状的一个管理过程。这一过程是通过一个反馈环路进行的。l）确定控制的对象；2）规定控制对象的标准（预期值）；3）制定或选择控制方法和手段；4）测量实际数据；5）比较或较对实际数据与预期值之间的差异，并说明产生这一差异的原因。超出预定误差范围，报警系发出信号，反馈通道中断。6）采取行动，解决差异。恢复原状（原标准状态）的手段发挥作用。质量控制主要采用质控图进行。质控图是把某一检验的性能数据与所计算出来的预期的“控制限”进行比较的图。这种性能数据是在按规程正常进行时，按时间顺序而抽选出来的，其目的是检测检验过程中变异的“可追查”性原因。“可追查”性的误差原因，是指除去随机误差以外的其他原因。“控制限”是通过统计计算出来的，详细介绍见室内质控程序。1.2校准品1.2.1校准品：参考物质，其值为校准功能中用的自变量。1.2.2校准等级：按照VIM：19933）定义，校准是指“一系列的操作，用以在特定条件下建立定量值与相应标准品的真值之间的关系，该定量值可能来自某一测量仪器或测量系统或者是某一物品或参考品测量的表达值”。此定义提示需要一种参考测量程序来设定校准品的数值。不同要求的参考测量程序定义不同。最高计量学规则是一级参考测量程序（选定方法），次级计量学规则是二级参考测量程序（由计量学会制定）或国际常规参考测量程序（由国际学术组织制定）。在血液学领域，最新的就是先前提到的参考方法。无论是否有分类，如新的自动参数，最高计量学规则可以是厂家选择的测量程序。每个测量程序用于校准品定值，分别代表一级校准品、二级校准品或厂家工作校准品。血细胞计数参数还没有一级测量程序，或一级参考物。近年，国际常规参考测量程序在全血细胞计数的参数设置方面已有进展。最近，如XE-2100的幼稚粒细胞计数新参数，其最高计量学规则可能就是厂家选择的测量程序。1.2.3厂家产品校准品：按照厂家常规测量程序定值，用于校准终端用户常规测量程序。如：SysmexSCS-1000、Coulter、Abbttol血液校准品能用于WBC，RBC，PLT，HGB和HCT的校准，血细胞计数参数还没有一级测量程序，或一级参考物。近年，国际常规参考测量程序在全血细胞计数的参数设置方面已有进展。最近，如XE-2100的幼稚粒细胞计数新参数，其最高计量学规则可能就是厂家选择的测量程序。1.3全血质控物：采用醛化的人血，定值分装而成，只能用于质控，不能用于仪器的校准，两者不能混为一谈。“好的开端是成功的一半”，分析前的质量控制不容忽视，选择适当的质控方式非常重要。二、血细胞分析的质量控制（一）分析前的质量控制1.标本采集的质量控制：血标本的采取应注意的问题1）采血试管选用专做血常规的小型带盖的塑料试管或玻璃试管，内壁均需硅化处理，否则易造成血小板粘附，影响测定结果。目前多采用真空采血管。2）抗凝剂及比例选用EDTA－KZ，室温下其溶解较快，特别适合全血细胞分析及红细胞比积测定，室温下6h红细胞体积不改变，抗凝剂最好干烤在试管上，l.5mg可抗凝05～15ml血液，当然抗凝剂浓度过高，易造成细胞外液高渗状态，影响细胞的正常形态。抗凝剂浓度过低，起不到抗凝作用，血液中易产生凝块。3）采血采用静脉血，对难以采取的儿童或烧伤患者取末梢血。由于末梢血中混入组织液，造成血液稀释，可使各项测定值偏低，末稍血血小板比静脉血一般偏低2%～5%。当然对于末梢血血小板采集时，由于采血量较大，还存在挤压使血小板可能集聚，故取血要选择暴露明显的静脉等。4）采血后标本的处理及放置时间采血后的标本要轻轻充分混匀。混匀后宜放置10～15min，否则抗凝剂未充分与血液作用，易造成中等大小细胞（MID）假性升高。若放置时间大于6h，易造成血小板等有形成分破碎，使结果偏低。2．仪器工作环境的监测及控制：血细胞分析仪要求在无尘、无磁场、静电干绕、15～30度环境工作。3．仪器的校准及质控物测定采用仪器厂家给定的校准液（有效期内使用），重复3次取均值。对RBC、WBC、BPC及MCV进行定期校准。校准后用高、中、低三个质控液进行测定，如果测定值不在允许范围内，仪器需重新校准。每月校正一次，每天进行质控物测定，并建立质控图，观察是否失控。★血细胞分析室内质量控制方式的选择及程序设计1．质控方式及设计过程质控方式：适合于血细胞分析的质控方式有1）Levy-Jeninings质控图；2）利用浮动均值法对仪器进行质量控制；3）Westgard多规则质控等。为了获得优化的性能，质控方法必须具有尽可能低的假失控概率（Pfr）和尽可能高的误差检出概率（Ped）。假失控概率和误差检出概率将依赖于质控规则和在分析批上质控测定值的个数（N）。1）Levy-Jeninings质控图设计过程：通过以下步骤来确定质控范围。①最佳条件下的测定误差。最佳条件下已知值质控血清变异（oPtimalconditionsvariance，简称OCV）的测定：在本实验室最佳条件下（包括操作者、试剂、仪器等）检测质控血清20-30次，测得结果计算，求出该组数据的均值和标准差（SD）表D示该实验室的最佳工作质量。②已知值的质控物在常规检验条件下的误差。常规条件下已知值质控变异（routineconditionsvariance－knownvalue，简称RCVK）的测定。做常规检验的技术人员，在常规检验的条件下，将质控血清放在常规检测样本中，进行20次检验，结果计算同OCV法。一般认为RCV的SD在OCV的SD两倍范围内可以接受。若太大应该查找原因，使其向OCV的SD值靠近。在改进实验室条件后，重新进行RCVK的测定。如果DRCVK的SD值更小．说明OCV不具最佳条件下测定的，应重新再测OCV。常现条件下，RCVK肯定要比OCV大。通过质控控制各项条件，使RCVK的数据尽可能尽可能接近OCV值。RCVK的数据反映该实验室日常工作的质量，用于作质控图，对室内检验的结果进行控制，每日检验的结果，报告能否发。③未知值的质控物在常规检验条件下的误差。常规条件下，未知值质控物变异（routineconditionsvariancl-unknownvalue简称RCVU）的测定，有时为了避免主观性，再作RCVU测定。测定步骤同RGVK，但检测的操作者不知质控血清的定值，或在操作作者不知哪份是质控物的条件下进行常规检验，以排除操作者的主观性。在此不再举例说明。④临床应用的要求。对任何一个试验都应确定一个允许的误差范围，前题是满足临床要求。如允许误差定得过小，在临床上不存在任何意义，但为了符合该规定却要花费很大人力、物力和时间。相反，如果将允许误差定得过大，将使监测系统察觉不到临床上要求检出的误差，失去质控的意义。⑤质控图通过以上三步骤，可以开始作室内质控图，根据RCVK的和SD作质控框图。一般认为：①一次超出3SD；②连续M次超出2SD；③3～5次连续处于一侧的2SD之内；④5～7次连续偏向横轴的一侧，均为失控。第③、④种情况，单独依靠记录往往是不易察觉的，但在质控图上可以清晰地发现这种失控。2）利用浮动均值法对仪器进行质量控制：仪器通过适当的设置，可每天随机抽取20份测定值进行统计。正常情况下，其MCH、MCV、MCHC的均值都在一定的范围内，若有较大的波动，说明可能失控，应及时找原因。3）Westgard多规则质控图及设计过程简要介绍质控方法设计步骤①以“允许总误差”（TEa）形式规定每一试验的临床质量要求，如采用美国临床实验室改进修正案（CLIA88）能力验证计划的评价限。②从1个月的质控物检测的值计算每一试验的稳定标准差（S）或变异系数（CV）；方法的不准确度（bias）是根据参加卫生部临床检验中心室间质评计划确定（测定结果与靶值之间的偏差）。③计算临界系统误差（△SEc）和临界随机误差（△REc）：△Sec=（TEa－|bias|）/s－1.65△REc＝（TEa－|bias|）/1.65s（bias≠0）④由计算机模拟程序确定候选质控方法的性能特征。通过图形插入法可估计假失控概率和误差检出概率。⑤设定质控方法检出系统误差概率90%为目标，同时维持尽可能低的假失控。随机误差高检出率是其次考虑的目标。⑥采用质控计算机模拟程序（QCCS）该程序由王治国开发，菜单提供多种质控规则，其中包括12s，12.5s，13s，13s/22s/R4s和Westgard多规则（13s/22s/R4s/41s/10x）。以1000模拟批获得失控概率的估计值。根据以上步骤，举例如下：CoulterJT血液分析仪（库尔特试剂和质控物）进行控制方法的设计。其分析项目有血红蛋白、红细胞、白细胞、血小板、红细胞压积、MCV、MCH、MCHC。★质量控制设计过程及设计步骤如下：1.以“允许总误差”（Tea）形式规定每一试验的临床质量要求，本研究采用的允许总误差为美国临床实验室改进修正案（CLIA’88）能力验证计划的评价限；2.从一个月控制物浓度值计算每一试验的稳定标准差（S）或变异系数（%）；方法的不准确度（偏差bias）是根据参加卫生部临床检验中心室间质评计划确定（测定结果与靶值之间的偏差）；3．计算临界系统误差（△SEC）和临界随机误差（△REC）：△SEc=（TEa－|bias|）/s－l.65△REC=（TE一|bias|）/1.65s（bias≠0）4．由计算机模拟程序确定候选控制方法的性能特征。通过图形插入法可估计假失控概率和误差检出概率。5选择控制方法检出系统误差概率90%为目标，同时维持尽可能低的假失控。随机误差高检出率是其次考虑的目标。★质量控制计算机模拟程序（QCCS）该程序由王治国开发，莱单提供多种控制规则，其种包括12s，12.5s，13s，13s/22s/R4s和Westgard多规则（13s/22s/R4s/41s/l0）。以1000模拟批获得失控概率的估计值。计算的临界系统误差和随机误差被表达为测定方法标准差的倍数；例如血红蛋白的△Sec=6.21相当于系统误差等于6.21倍的标准差；△REc＝4.77相当于标准差增加4.77倍。表1每一试验项目的允许总误差、分析的不精密度（变异系数）、不准确度（偏差biss）、临界系统误差△SEc和临界随机误差△REC试验项目单位控制物浓度允许总误差CV（%）biss（%）△SEc△REC★候选控制方法的性能特征图1，2，3分别显示的是几种控制规则检出系统误差的性能特征，其中N分别为1，2，4。利用模拟研究获得的功效函数图，即是失控概率与分析误差大小的关系图。对于下面的试验，血红蛋白、红细胞、白细胞、红细胞压积、MCV、MCH、MCHC用l3s控制规则（N=1）就能容易地达到90%以上的误差检出目标。对于红细胞、红细胞压积用l3s控制规则（N＝2）就能容易地达到90%以上的误差检出目标。对于血小板，使用Westgard多规则（l3s/22s/R4s/41s/1