白血病分子生物学

白血病分子生物学孙晓琳爱普益医学检验中心白血病分子生物学白血病的分子机制白血病的分子检测白血病分子检测的临床应用白血病的分子机制基因(gene)：合成有功能的蛋白质多肽链或RNA所必需的全部核酸序列。癌基因(oncogene)：细胞或病毒中存在的，能诱导正常细胞转化并使之获得新生物特征的基因。癌基因活化的方式：点突变染色体重排基因扩增抑癌基因(tumorsuppressorgenes)：指一类基因，其产物对细胞生长增殖起负调控的作用，并能潜在抑制细胞的恶变。白血病的分子机制白血病的分子机制增殖过度分化阻断凋亡受抑“二次打击”学说D.GaryGillilandBestPractice&ResearchClinicalHaematology.2003;16:409-417白血病的分子检测SouthernblotNorthernblotWesternblotFISHPCR测序芯片白血病的分子检测PCR反应原理N=N0x(1+E)nN：扩增子数量N0：起始模板数量E：扩增效率n：循环数白血病的分子检测PCR理论方程白血病的分子检测PCR方法优点快速灵敏特异PCR方法缺点假阳性假阴性白血病的分子检测PCR：仅适用于染色体断裂点丛集于相对小的范围内（2kb），如T-ALL中SIL-TAL1。RT-PCR：可用于染色体断裂点跨越很大的区域的融合基因。巢式RT-PCR：可显著提高反应的特异性，增加扩增效率。RQ-PCR：可定量扩增产物。白血病的分子检测RQ-PCR（Real-timeQuantitativePCR）荧光标记扩增产物荧光标记引物特异性荧光标记探针TaqMan探针、分子信标、杂交双探针荧光染料直接结合扩增产物SYBRGreenI与DNA双链结合动态监测荧光信号变化TaqMan探针法•特异性高•多重基因定量•成本较高SYBRGreenI法•成本低•最适合初步筛查•熔解曲线功能•无法多重检测•无模板特异性•灵敏度低白血病的分子检测CT值：荧光信号有统计学意义显著增长（穿过阈值线）时的循环次数CT值与起始模板量成反比白血病的分子检测RQ-PCR的检测系统：该系统内置了96孔PCR仪，且在每个反应孔上均有一个监测探头用于检测PCR反应管中的荧光强度。平均每8-12秒就检测一次，以达到实时检测的目的。系统中的电脑系统同时不断地分析来自检测系统的信息，不断计算每个反应管中的荧光强度，并最终得到CT值。该系统可以根据标准品的CT值和拷贝数自动绘制标准曲线，并计算未知样品中的目的基因拷贝数。白血病的分子检测RQ-PCR方法优点：灵敏而特异起点定量闭管化学（污染的风险低）没有PCR后处理（无需走胶，拍照等）高度自动化定性：单数据点测定定量：多数据点测定能做基因分型及SNP鉴定RQ-PCR的操作流程从细胞或组织中抽提DNA或RNA用PCR或RT-PCR扩增特异片段将PCR产物克隆到合适的载体上纯化，定量和系列稀释质粒DNA或RNA体外转录成RNA片段（仅用于RNA样品）构建标准曲线（CTυlgcopy）样品的定量检测校正样品基因拷贝数白血病分子检测的临床应用白血病的分子生物学检查对白血病诊断分型及预后判断有以下几方面意义：补充MIC检查的不足发现新的亚型监测白血病的微小残留病灶（MRD）为研究白血病的发病机制打下基础白血病分子检测的临床应用PCR方法检测MRD常用的分子标志AML1-ETOt(8;21)(q22;q22)6~8%原发性AML，在M2中的阳性率为20~40%，在M2b中阳性率为90%少见于M4和M1，极少见于MDS和骨髓增生综合症AML1-ETO+白血病细胞有一定程度的分化能力，能分化至较成熟的嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞，且对化疗反应较敏感AML1-ETO+患者对大剂量阿糖胞苷治疗效果好，具有较高的缓解率，无病生存期长，预后较其他AML亚型（M3除外）好AML1-ETO对初发患者进行t(8;21)和AML1-ETO融合基因的检测对其预后判断及治疗方案的制定相当重要AML1-ETO定性结果不能用于评价患者MRD情况RQ-PCR能实时反映体内AML1-ETO水平。连续定量AML1-ETO转录本水平可判定有高复发风险的患者，以便及早治疗干预以防血液学复发AML1-阴性ETO+C-KIT基因突变C-KIT为III型受体酪氨酸激酶家族（还包括c-FMS，PDGFRβ和c-KIT）成员之一AML1-ETO可诱导性表达的转基因小鼠，并不导致白血病发生C-KIT突变可见于伴inv(16)的M4以及伴t(8;21)的M2患者26/54例(48.1%)M2b患者中检测到C-KIT基因突变57例不伴t(8;21)的其他类型血液肿瘤患者均未检测到C-KIT基因突变以上结果提示C-KIT突变与M2b密切相关(R=0.94,P0.01)C-KIT基因突变C-KIT基因结构JMC-KIT基因突变外周血白细胞计数C-KIT基因突变生存曲线PML-RARαt(15;17)(q22;q21)98%M3患者继t(15;17)之后，又先后发现4种M3特异的累及RARα的变异性染色体易位：t(11;17)(q23;q21)，t(5;17)(q35;q21)，t(11;17)(q13;q21)以及dup(17)(q21.3;q23)，分别产生PLZF-RARα，NPM-RARα，NuMA-RARα和STAT5b-RARα融合基因临床上，具有PLZF-RARα或STAT5b-RARα融合基因患者对ATRA治疗不敏感，其余三种染色体易位患者经ATRA治疗可获完全缓解PML-RARαAPL累及的RARα基因及其伙伴基因结构示意图PML-RARα由于PML基因断裂点不同产生3种不同的PML-RARα异构体约55%的M3患者为L型，40%为S型，5%为V型，且每位患者只表达一种PML-RARα融合蛋白形态学上S型白血病细胞常为低分化的并且这些患者可见继发细胞遗传学异常，V型APL患者的白血病细胞体外对ATRA的敏感度低PML-RARαRT-PCR检测PML-RARα是敏感且特异的APL诊断方法，还能用于治疗后MRD监测。PML-RARα阳性提示的分子复发常早于临床复发3-6个月，为临床采取进一步治疗措施提供了保障RQ-PCR能有效反映患者在发病、治疗、缓解、复发整个过程的白血病细胞负荷，在MRD监测中比RT-PCR具有更高价值L+阴性S+FLT3基因突变Fms-relatedtyrosinekinase3FLT3为III型受体酪氨酸激酶家族（还包括c-FMS，PDGFRβ和c-KIT）成员之一，该类受体因在造血过程中造血细胞的增殖和存活中发挥重要调控作用综合国外各研究报道，FLT3-ITD和D835突变在AML中阳性率分别为24%(385/1585)和7%(30/429)，总阳性率超过30%，使其成为AML中最普遍发生突变的靶基因许多临床研究发现，FLT3突变还与临床预后密切相关，尤对60岁以下的AML患者，FLT3突变患者预后较差，且可独立于核型之外FLT3基因突变FLT3基因突变FLT3基因主要突变类型FLT3基因突变mut-FLT3信号通路FLT3基因突变外周血白细胞计数020406080100120140160FLT3-ITD-FLT3-ITD+APL患者初发时外周血WBC计数(x109)CBFβ-MYH11inv(16)(p13;q22)及t(16;16)(p13;q22)主要见于M4Eo，10%不伴异常嗜酸细胞M4，少见于M2CBFβ-MYH11融合蛋白通过干扰核心结合因子（corebindingfactor,CBF）的转录激活作用而致病具有CBFβ-MYH11的患者对化疗敏感，预后较好，故提高检测率尤具临床意义CBFβ-MYH11CBFβ-MYH11具有多种变异型，其中最常见的为A型，占80%RT-PCR检测CBFβ-MYH11进行MRD监测显示，大部分患者在完全缓解时PCR转阴，但仍有小部分长期存活者PCR仍为阳性最新研究采用RQ-PCR检测CBFβ-MYH11转录本水平来评价M4Eo患者MRD情况，预示复发NPM基因突变Nucleophosmin，为核-浆穿梭蛋白，调控p53-ARF通路见于~50%核型正常的AML患者，而在伴低危/高危核型患者中极少见主要见于M4/M5中第12号外显子的插入/缺失伴此突变患者WBC计数高目前，此突变的预后价值各研究组报道不一，尚待进一步证实DEK-CANt(6;9)(p23;q34)主要见于M2或M4，也见于M1，MDS-RAEB伴DEK-CAN的患者年龄一般较轻，且预后较差此类患者进行分子监测有助于判断患者预后，调整治疗方案N-RAS基因突变为RAS基因家族成员之一，染色体定位于1p32.2。具有GTP/GDP结合和GTPase活性，调控正常细胞的生长此基因突变存在于11-30%AML突变热点位于codon12,13和61在inv(16)/t(16;16),inv(3)/t(3;3)中突变率较高，而在t(15;17)中低伴此突变患者外周血WBC计数低该突变预后意义尚不明WT-1基因高表达Wilmstumor1是无特异分子异常的急性白血病患者理想的MRD检测指标伴此基因高表达者预后差，且表达程度与预后相关BCR-ABLt(9;22)(q34;q11)15~30%成人ALL及3~5%儿童ALL9号染色体的断裂点与CML相同，但22号染色体断裂点具有异质性此融合蛋白p190刺激细胞增殖的能力比p210要强。在转基因试验中观察到p190诱发的白血病具有起病早、发展快和恶性程度高的特点BCR-ABL+ALL患者预后差，5年存活率20%，因此这些患者在缓解后需进行骨髓移植治疗BCR-ABL对于自体或异体移植ALL患者，移植前后BCR-ABL的有无以及BCR-ABL的转录本类型与预后有关e1a2+阴性E2A-PBX1t(1;19)(q23;p13)5~6%儿童ALL和3%成人ALL此类患者具有高的白细胞计数，高的血清乳酸脱氢酶及中枢神经系统症状，预后差，平均无病生存期（DFS）仅6个月，3年DFS为20%，需给予这些患者强化治疗才能获得较好的预后核型和E2A-PBX1检测对此类患者的诊断和治疗方案的选择至关重要E2A-PBX1的预后价值需更多的临床研究证实TEL-AML1t(12;21)(p13;q22)25%儿童ALL，是儿童ALL中最常见的分子异常目前为止尚未在T-ALL，AML或NHL中发现t(12;21)，在婴儿白血病中极少报道，在成人白血病患者中频率很低（2%）此类患者发病年龄小（2岁~10岁），WBC计数低（50000/L），免疫表型为前B-ALL此类患者对治疗反应佳，完全缓解时间长，预后好TEL-AML1由于12p和21q末端在常规显带中很相似，因此常规细胞遗传学方法检出率仅0.05%，需应用FISH或RT-PCR方法提高检测阳性率TEL基因重排是独立预后因素，RT-PCR检测TEL-AML1融合基因能将低危险度与高危险度的ALL患者区分开来。因此早期检测TEL-AML1融合基因对临床预后，确定合适的治疗方案都有重要意义MLL相关融合基因累及MLL基因的分子异常见于5.2%AML，22%ALL和混合性白血病及某些淋巴瘤，还可见于治疗相关白血病，尤接受topoisomeraseII抑制剂治疗的患者MLL基因涉及五十余种染色体易位，产生不同的融合蛋白，且每种融合蛋白都与特定的白血病表型相关。最常见的有：t(4;11)(q21;q23)MLL-AF4融合基因ALLt(9;11)(p22;q23)MLL-AF9融合基因AMLt(11;19)(p13;q23)MLL-ENL融合基因AML及ALLMLL相关融合基因至今，MLL相关融合蛋白的致病性还不清楚，推测其可能具有双重作用：——融合蛋白可