1.1DNA重组技术的基本工具和基本操作程序

基因工程是指按照人们的意愿，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。（P1）抗虫棉普通棉基因工程的别名操作环境操作对象操作水平基本过程原理结果基因拼接技术或DNA重组技术生物体外基因DNA分子水平人类需要的基因产物剪切→拼接→导入→表达基因重组基因工程的概念一、DNA重组技术的基本工具“分子手术刀”──“分子缝合针”──“分子运输车”──限制酶DNA连接酶基因进入受体细胞的载体（一）限制性核酸内切酶——“分子手术刀”1.分布：2.特点：专一性，即能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且切割每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，使之断开。主要从原核生物中分离纯化出来的一类酶。GAATTCCTTAAGGCTTAAGAATTCCCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGCCC︰︰︰︰︰中轴线︰︰︰︰↓↑EcoRⅠ（在G与A之间切割）SmaⅠ（在G与C之间切割）粘性末端平末端↓↑在识别序列中轴线两侧切割，产生粘性末端；在识别序列中轴线处切割，产生平末端。3.结果：思考要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？两个切口，四个黏性末端。GCTTAAAATTCGGCTTAAAATTCG（二）DNA连接酶——“分子缝合针”GCTTAAAATTCG（二）DNA连接酶——“分子缝合针”2.连接酶的部位：磷酸二酯键，不是氢键GCTTAAAATTCG磷酸二酯键磷酸二酯键1.连接酶的作用：将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的DNA分子（二）DNA连接酶——“分子缝合针”3.连接酶的类型（按来源分类）(1)E.coliDNA连接酶：(来源于大肠杆菌)只能连接双链DNA片段互补的粘性末端(2)T4DNA连接酶：（来源于T4噬菌体）既可以连接双链DNA片段互补的粘性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端,但连接平末端之间的效率比较低。DNA聚合酶和DNA连接酶有何相同点和不同点？DNA连接酶DNA聚合酶连接DNA链数连接部位相同点双链单链在两DNA片段之间形成磷酸二酯键将单个核苷酸加到已存在的核酸片段上，形成磷酸二酯键都能形成磷酸二酯键（三）基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”1.作用：2.条件：•能在宿主细胞内复制并稳定地保存；•具有多个限制酶切位点,便于目的基因插入；•具有标记基因，便于筛选；•必需是安全的，对宿主细胞无害。将外源基因送入受体细胞3.种类：质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等质粒细菌拟核DNA之外能自主复制的小型双链环状DNA分子在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。二、基因工程的基本操作程序目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定第一步第二步第三步第四步（一）目的基因的获取1、目的基因主要是指________________，也可以是一些具有调控作用的因子。编码蛋白质的基因2、获取目的基因的常用方法有哪些?（1）从基因文库中获取目的基因（2）利用PCR技术扩增目的基因（3）人工合成目的基因原核细胞的基因结构原核细胞基因编码区（编码序列）：能指导有关蛋白质的合成，即能够编码蛋白质非编码区（调控序列）：位于编码区上游和编码区下游的DNA序列，虽不能指导有关蛋白质的合成，但有调控遗传信息表达的核苷酸序列，如启动子、终止子等真核细胞的基因结构真核细胞基因编码区（间隔、不连续）外显子：能编码蛋白质的DNA序列内含子：不能编码蛋白质的DNA序列非编码区：与原核生物具有相似功能的启动子、终止子基因文库的构建基因组文库的构建提取某生物全部DNA用适当限制酶切割许多DNA片段与载体连接导入受体菌群该生物基因组文库（每个受体菌含有一段不同的DNA片段）cDNA文库的构建——mRNA反转录形成mRNA逆转录酶杂交双链核酸酶H单链DNADNA聚合酶双链DNA与载体连接导入受体菌群该生物cDNA文库1.下列关于基因工程中限制酶的描述，错误的是（）A.一种限制酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列B.限制酶的活性受温度的影响C.限制酶能识别和切割RNAD.限制酶可从原核生物中提取C2.不属于质粒被选为基因运载体的理由是（）A、能复制B、有多个限制酶切点C、具有标记基因D、它是环状DNAD3、下列关于限制酶的说法正确的是（）A、限制酶广泛存在于各种生物中，但微生物中很少B、一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列C、不同的限制酶切割DNA后都会形成黏性末端D、限制酶的作用部位是特定核苷酸形成的氢键B4.下图为DNA分子结构示意图，对该图的正确描述是A．④的名称是胞嘧啶脱氧核苷酸B．解旋酶作用的部位是⑨C．某限制性核酸内切酶可选择⑨处作为切点D．DNA连接酶可连接⑩处断裂的化学键BD①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术③条件：___________、_______________、___________、___________.②原理：__________多聚酶链式反应体外特定DNA片段DNA双链复制模板DNA四种脱氧核苷酸DNA引物热稳定DNA聚合酶利用PCR扩增目的基因④过程高温变性(DNA解旋)（90~95℃）低温退火(引物结合)（55~60℃）中温延伸(互补链合成)（70~75℃）双链DNA是在高温条件下解链为单链DNA的，因此整个过程不需要解旋酶。多次重复⑤特点：指数形式扩增目的基因的mRNA单链DNA双链DNA(即目的基因)反转录合成1）反转录法：蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列目的基因推测推测化学合成2）化学合成法:人工合成：质粒目的基因限制酶DNA连接酶重组质粒（二）基因表达载体的构建——核心1.构建目的使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。2.构建零件及其作用（1）目的基因（2）启动子RNA聚合酶识别和结合的一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，RNA聚合酶与之结合才能驱动基因转录出mRNA，进而获得需要的蛋白质。（二）基因表达载体的构建——核心（3）终止子一段特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端，作用是使转录在所需要的地方停止。（4）标记基因鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。2.构建零件及其作用(5)复制原点（二）基因表达载体的构建——核心（三）将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化。基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌和动植物细胞等。导入受体细胞的方法主要是借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径，且因受体细胞的不同而不同。（1）农杆菌转化法1.导入植物细胞（2）其他方法•基因枪法•花粉管通道法移植显微注射分裂分化发育2.导入动物细胞(显微注射技术)含目的基因的表达载体动物的受精卵含目的基因的受精卵早期胚胎雌性动物输卵管或子宫转基因动物3.导入微生物细胞(2)优点(3)常用受体细胞(1)过程•制备感受态细胞：用Ca2+（CaCl2）处理细菌，使细菌易于接受外源DNA分子。•重组DNA分子与感受态细胞混合，完成转化。(Ca2+处理法)繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少、操作简单、价格低廉。大肠杆菌（E.coli）（四）目的基因的检测与鉴定检测①导入检测：目的基因是否导入受体细胞方法——DNA分子杂交②表达检测转录检测——分子杂交翻译检测——抗原抗体杂交分子检测法鉴定抗虫鉴定抗病鉴定活性鉴定等个体水平的鉴定1.用基因工程技术可使大肠杆菌合成人的蛋白质。下列叙述不正确的是（）A.常用相同的限制性核酸内切酶处理目的基因和质粒B.导入大肠杆菌的目的基因不一定能成功表达C.DNA连接酶和RNA聚合酶是构建重组质粒必需的工具酶D.可用含抗生素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒C2.科学家常选用的细菌质粒往往带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因的主要作用是（）A、提高受体细胞在自然环境中的耐热性B、有利于检测目的基因是否导入受体细胞C、增加质粒分子的相对分子质量D、便于与外源基因连接B3.下图是基因工程主要技术环节的一个基本步骤，这一步需用到的工具是（）A、DNA连接酶和解旋酶B、DNA聚合酶和限制性核酸内切酶C、限制性核酸内切酶和DNA连接酶D、DNA聚合酶和RNA聚合酶C4．下列有关基因工程技术的正确叙述是（）A．重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、连接酶和载体B．所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列C．选用细菌作为重组质粒的受体细胞是因为细菌繁殖快D．只要目的基因进入了受体细胞就能成功实现表达C5.科学家运用基因工程技术将人胰岛素基因与大肠杆菌的质粒DNA分子重组，并且在大肠杆菌体内获得成功表达。胰岛素基因与大肠杆菌质粒DNA彼此能结合的依据是（）A．基因自由组合定律B．半保留复制原则C．基因分离定律D．碱基互补配对原则D6.2003年在中国大地上最惨烈的事件就是“非典”侵袭、肆虐着人体的健康，夺取了许多人宝贵的生命。医院人满为患，“非典”与“发热”、“疑似”混杂在一起，让医生难以区分。我国科学工作者日夜奋战，利用基因工程迅速研制出“非典”诊断盒。其作用机理是（）A．治疗“非典”利用的是抗原—抗体反应B．诊断“非典”利用的是DNA分子杂交原理C．诊断“非典”利用的是抗原—抗体反应D．治疗“非典”利用的是DNA分子杂交原理B7.天然酿酒酵母菌通常缺乏分解淀粉的酶类，用作发酵原料的淀粉需经一系列复杂的转化过程才能被利用。研究者从某丝状真菌中获取淀粉酶基因并转入酿酒酵母菌，获得的酿酒酵母工程菌可直接利用淀粉产生酒精。请回答下列问题：⑴将淀粉酶基因切割下来所用的工具是____________，用___________将淀粉酶基因与载体拼接成新的DNA分子，下一步将该DNA分子___________，以完成工程菌的构建。⑵若要鉴定淀粉酶基因是否插入酿酒酵母菌，可采用的检测方法是____________；若要检测淀粉酶基因是否翻译成淀粉酶，可采用___________________检测。限制酶DNA连接酶导入酵母菌DNA分子杂交抗原一抗体杂交8．多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。PCR过程一般经历下述三十多次循环：95℃下使模板DNA变性、解链→55℃下复性（引物与DNA模板链结合）→72℃下引物链延伸（形成新的脱氧核苷酸链）。下列有关PCR过程的叙述中不正确的是（）A．变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现B．复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成C．延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸D．PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高C含重组质粒土壤农杆菌抗虫基因含kan质粒重组质粒A构建土壤农杆菌导入B培养选择侵染转基因抗虫植株离体棉花叶片组织愈伤组织C诱导选择再生植株分化D检测9.在培育转基因植物的研究中，卡那霉素抗性基因（kanr）常作为标记基因，只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基上生长。下图为获得抗虫棉的技术流程。请据图回答：（1）A过程需要的酶有_____________________________________。（2）B过程及其结果体现了质粒作为运载体必须具备的两个条件是__________________________________________________。（3）C过程的培养基除含有必要营养物质、琼脂和激素外，还必须加入________________。（4）如果利用DNA分子杂交原理对再生植株进行检测，D过程应该用___________________________________________作为探针。限制酶和DNA连接酶具有标记基因；能