烟草可培养内生细菌的分离及多样性分析

微生物学通报SEP20,2011,38(9):1347−1354MicrobiologyChina©2011byInstituteofMicrobiology,[e-mail]基金项目：国家自然科学基金项目(No.30860017)*通讯作者：Tel:[phone];:[e-mail]收稿日期：2011-01-27;接受日期：2011-05-16研究报告烟草可培养内生细菌的分离及多样性分析陈泽斌1,2夏振远1*雷丽萍1陈海如2(1.云南省烟草农业科学研究院云南玉溪653100)(2.云南农业大学植物保护学院云南昆明650201)摘要:采用稀释平板法,从健康烟草的根、茎、叶组织中分离到267株内生细菌。利用细菌菌落表征性状和16SrRNA序列对这些分离物进行了多样性分析。通过数值分析比较了8个菌落形态表征性状,以类平均连锁聚类法的方式进行聚类分析,在2.15的水平上可分成5个聚类群和56个亚群。16SrDNA序列系统发育分析表明267株分离物可分为21个类群。研究表明同一菌落形态类型的菌株在系统发育树中不一定聚为一类,菌落形态分类与分子生物学方法分类结果不完全一致。经克隆测序分析表明,这267株分离物分别与GenBank中6类细菌中的21个已知种相似性达到98%−99%。其中芽孢杆菌属(Bacillus)细菌是烟草可培养内生细菌的优势种群。关键词:烟草,可培养,内生细菌,微生物多样性DiversityofcultivableendophyticbacteriaisolatedfromtobaccoCHENZe-Bin1,2XIAZhen-Yuan1*LEILi-Ping1CHENHai-Ru2(1.YunnanAcademyofTobaccoAgriculturalSciences,Yuxi,Yunnan653100,China)(2.PlantProtectionCollege,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming,Yunnan650201,China)Abstract:267endophyticbacteriaoftobaccowereisolatedfromroots,stemsandleavesbythemethodofgrindingseparation.Apreliminaryanalysiswasmadeonthediversityoftheisolatesbyphenotypiccharacteristicsandmolecularclassificationmethodsbasedonpartial16SrDNAsequences,theanalyti-calcomparisonwasalsomadebetweenthem.267bacteriaisolateswereseparatedwith8differentphenotypiccharacteristics,andweregroupedinto5clustersand56subclustersatthelevelof2.15withnumericalclassifiedbasedontheunweightedpairgroupmethodwitharithmeticaveragesalgorithm,andtheywereclusteredinto21moleculargroupsbasedonpartial16SrDNAsequences.Theresultsshowthattherearemuchmorephenotypictypesthanmoleculargroups,phenotypiccharacteristicswasnotconsis-tentwiththeresultsofmolecularclassificationexactly.Theresultofsequenceanalysisofthe16SrDNAshoweda98%−99%homologywith21speciesintheGenBank.Thedominantbacterialgroupsofto-baccoendophyticbacteriabelongtoFirmicutes,Bacillusgenera.1348微生物学通报2011,Vol.38,No.9:Tobacco,Culturablity,Endophyticbacteria,Diversityofmicroorganism20世纪50年代至今,人们已经先后从番茄、棉花、富贵竹、辣椒、甜瓜、哈密瓜、柠檬、红树林、茶树、黄花夹竹桃、黄瓜、小麦、玉米、马铃薯和水稻等多种不同种类的植物中分离得到多种内生细菌[1−3]。大量研究结果表明,植物内生细菌具有丰富的生物多样性,目前已经发现超过129种(隶属于54个属)的植物内生细菌[4]。其中以假单胞菌、芽孢杆菌、肠杆菌以及土壤杆菌为优势种群[5–6]。目前研究比较系统的植物有棉花、小麦和花生等。而对于烟草的相关研究主要集中在防病、促生内生细菌的筛选及其机理方面,对于烟草内生细菌多样性的研究国内鲜见报道。内生细菌的分类学研究是内生细菌多样性研究中必不可少的环节,能否对内生细菌进行正确的鉴定分类,特别是种内关系的鉴定分类,直接关系到能否正确揭示内生细菌的多样性和系统发育,目前内生细菌分类鉴定方法主要包括以其形态学或生理生化特征为依据的表型分类法和利用现代技术方法进行分类,如近年来发展起来的化学鉴定、数值分类法和分子生物学技术等。邓墨渊等[7]认为,现阶段我国应用的植物内生细菌分类方法主要是表型分类法和分子生物学技术相结合进行分类的方法。为了全面了解烟草可培养内生细菌的多样性,本实验室对烟草不同器官的内生细菌进行分离并鉴定,以表型分类法和分子生物学分类法对得到的267株分离物的多样性进行了比较分析,以获取其表型及种类组成特征,为下一步有益内生细菌的筛选和研究打下基础。1材料与方法1.1样品的采集和处理以烟草旺长期的根、茎、叶为试验材料,包括28个叶片样品、7个茎部样品和4个根部样品,样品采自云南省玉溪市,采样时间为2009年7月上旬,烟草品种为K326。采样时选择生长性状良好、无病害症状的健康植株。样品从植株分离后立即放入无菌样品袋中,低温保鲜,在24h之内进行内生细菌的分离。1.2培养基及主要试剂内生细菌分离和培养用NA培养基[8]、液体培养用LB,内生细菌DNA提取、16SrDNA片段扩增所用的各种酶、Marker、dNTPs、Buffer等试剂为宝生物工程(大连)产品,其余试剂均为国产分析纯。1.3烟草材料表面灭菌及效果检验将烟草的根、茎、叶分别用自来水冲洗干净后,随机称取0.4g,先在70%酒精中振荡浸泡1min,再用有效氯含量1%的次氯酸钠溶液振荡浸泡1−5min,无菌水冲洗4次。将最后一次的冲洗水涂布NA平板,以无菌水冲洗但未经消毒剂处理的材料为对照,28°C培养48h后记录菌落数,检测组织表面是否带菌,计算表面除菌率。表面除菌率=(未经消毒剂处理的材料表面细菌数−消毒剂处理后的材料表面细菌数)/未经消毒剂处理的材料表面细菌数×100%[9]。1.4内生细菌的分离取经检验表面灭菌彻底的材料0.4g,与一大一小灭菌钢珠一并放入2mL灭菌离心管中,加入600μL无菌水,用QIAGEN高通量组织研磨器研磨3min,频率为30r/s。研磨后的汁液梯度稀释10−104倍,各取200μL匀浆液涂NA平板,每处理重复4次。28°C黑暗培养48h后根据菌落形态、颜色等不同挑取单菌落,重新于NA平板上划线纯化,挑取划线培养的单菌落移入NA试管斜面保存。1.5表型特征的统计及聚类分析根据菌落的形状、大小、边缘特征、干湿、颜色、质地、表面光滑与否和透明度8个指标对菌落形态进行初步归类[10],并将结果按照表1进行编码后输入计算机,去除全同性状,对于菌落形态完全相同的菌株则只选取1株作为代表菌株,用DPS7.05版按类平均连锁聚类法进行系统聚类分析,得出表型特征的数值分类聚类图。1.6内生细菌的16SrRNA序列分析用TaKaRaMiniBESTBacterialGenomicDNAExtractionKitVer.2.0提取全部分离物的细菌基因组DNA,方法参见试剂盒说明书。PCR反应陈泽斌等:烟草可培养内生细菌的分离及多样性分析1349体系(50μL)组成:10×PCRBuffer5μL,dNTPs(10mmol/L)4μL,引物F27/R1492[11](10μmol/L)各2μL,模板DNA(约50g/L)1μL,Taq酶2.5U,双蒸水35.5μL。PCR扩增按Sambrook方法[12]进行。扩增产物经TaKaRaAgaroseGelDNAPurificationKitVer.2.0回收后,连接于载体pMD18-TVector(TaKaRa),转化入感受态细胞E.coliDH5α,挑取白色菌落以M13F/M13R为引物进行菌落PCR鉴定。阳性克隆委托上海英骏生物技术有限公司进行序列测定,通过BLAST寻找与目的序列同源性最高的已知分类地位菌种的16SrRNA序列进行比较鉴定,通过MEGA5.0进行比对,随后选用MaximumCom-positeLikelihood距离模型进行UPGMA分析生成系统发育树,发育树用Bootstrap法(100次重复)检验。2结果与分析2.1内生细菌的分离一共从烟草的根、茎、叶中分离纯化得到内生细菌267株(图1),其中42株分离自根部,32株分离自茎部,193株分离自叶片(表2)。表面灭菌效果检验表明(表3),用1%NaOCl进行表面灭菌时,烟草不同器官所需灭菌时间有差异。其中根部样品经5min灭菌处理后除菌率才能达到100%,叶片仅需1min表面除菌率便可达到100%,茎需要3min可达到100%。这与烟草各器官的组织致密性及所处生长环境有关。考虑到消毒时间过长,消毒剂渗入可能会杀死部分内生细菌,对内生细菌的多样性研究有影响,因此,本文采用能使除菌率达到100%的最短灭菌时间,即叶片1min、茎3min、根5min。表1细菌聚类分析特征Table1Theclusteringanalyticalcharacteristictableofbacteria序号Thenumberofeachcharacter性状Characters描述-编码Description-Number1形状点状−1;圆形−2;不规则形,水渍状−3;不规则形−4;不规则形,线状−5;圆形,水渍状−62大小数值单位:mm3干湿干−1;湿−2;湿,粘稠−34颜色黄色−1;乳白色−2;米黄−3;白色−4;浅黄−5;乳黄−6;粉红−75质地有光泽−1;无光泽−06表面凸起−0;扁平−1;凹凸不平−2;扁皱−3;内凹−47边缘整齐−0;不整齐−18透明度透明−0;不透明−1;半透明−2图1培养48h的部分菌落实体照片Fig.1Pictureofsomecoloniesoftobaccoendophyticbacteria注:显示菌落的形态差异,未显示菌落大小.Note:Thesepicturesmainlydisplaythemorphologicalvariationofthebacteriacoloniesanddonotshowthesizeofthem.1350微生物学通报2011,Vol.38,No.9表2烟草内生细菌的种类及分布Table2Thespeciesanddistributionoftobaccoendophyticbacteria种类Species各部位分离株数Numberofisolatesfromdifferentparts门、纲Phylu