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作业一：一、名词解释：1、基因：是遗传的物质基础，是DNA（脱氧核糖核酸）分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列的总称，是具有遗传效应的DNA分子片段。2、基因组该指单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部DNA分子3、操纵子:原核生物的几个功能相关的结构基因往往排列在一起，转录生成一个mRNA，然后分别翻译成几种不同的蛋白质。这些蛋白可能是催化某一代谢过程的酶，或共同完成某种功能。这些结构基因与其上游的启动子，操纵基因共同构成转录单位，称操纵子。4、启动子:是RNA聚合酶结合位点周围的一组转录控制组件，包括至少一个转录起始点。在真核基因中增强子和启动子常交错覆盖或连续。有时，将结构密切联系而无法区分的启动子、增强子样结构统称启动子。5、增强子:是一种能够提高转录效率的顺式调控元件，最早是在SV40病毒中发现的长约200bp的一段DNA，可使旁侧的基因转录提高100倍，其后在多种真核生物，甚至在原核生物中都发现了增强子。增强子通常占100～200bp长度，也和启动子一样由若干组件构成，基本核心组件常为8～12bp，可以单拷贝或多拷贝串连形式存在。6、基因表达：是指细胞在生命过程中，把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子。二、简答题1、说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。答：限制性内切核酸酶采用三字母的命名原则,即属名+种名+株名的各一个首字母,再加上序号.基本原则:3-4个字母组成,方式是:属名+种名+株名+序号;首字母:取属名的第一个字母,且斜体大写;第二字母:取种名的第一个字母,斜体小写;第三字母:(1)取种名的第二个字母,斜体小写;(2)若种名有词头,且已命名过限制酶,则取词头后的第一字母代替.第四字母:若有株名,株名则作为第四字母,是否大小写,根据原来的情况而定,但用正体.顺序号:若在同一菌株中分离了几种限制酶,则按先后顺序冠以I,Ⅱ,Ⅲ,…等,用正体.2、什么是限制性内切核酸酶的星号活性？受哪些因素影向？答：Ⅱ类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性，但是这种特异性受特定条件的限制，即在一定环境条件下表现出来的特异性。条件的改变，限制酶的特异性就会松动，识别的序列和切割都有一些改变，改变后的活性通常称第二活性，而将这种因条件的改变会出现第二活性的酶的右上角加一个星号表示，因此第二活性又称为星号活性。概括起来，诱发星活性的因素有如下几种：(1)高甘油含量(5％,v／v)；(2)限制性内切核酸酶用量过高(100U／ugDNA)；(3)低离子强度(25mmol／L)；(4)高pH(8.0以上)；(5)含有有机溶剂，如DMSO，乙醇等；(6)有非Mg2+的二价阳离子存在(如Mn2+，Cu2+，C02+，Zn2+等)。3、影响DNA连接酶催化连接反应的因素有哪些？答：（1）DNA的纯度（2）DNA甲基化的程度（3）酶切消化反应的温度（4）DNA的分子结构（5）核酸内切限制酶的缓冲液4、什么是Klenow酶？有哪些活性？在基因工程中有什么作用？答：Klenow酶是1974年Klenow用枯草杆菌蛋白酶水解DNA聚合酶I，得到两个片段，其中大片段的分子量为75kDa，它具有5'-3'聚合酶和3'-5'外切核酸酶的活性，小片段具有5'-3'外切核酸酶活性。由于大片段失去了DNA聚合酶I中会降解5'引物的5'-3'外切核酸酶的活性，所以在基因工程中更有用。Klenow酶主要有下列用途：(1)修复反应，制备平末端可用Klenow酶修复限制性内切核酸酶或其他方法产生的5'或3'突出末端，制备平末端，这样可以使原来具有不相容的黏性末端的DNA片段通过平末端重组。如在反应系统中加入放射性同位素标记的脱氧核苷酸，用这种末端填补的方法可以制备3'末端标记的探针。用Klenow酶修复5'突出末端的反应主要是利用了Klenow酶的DNA聚合酶活性，是填补反应；而修复3'突出末端则是用Klenow酶的3'-5'外切核酸酶的活性，是切割反应。用Klenow酶的切割反应来修复3'突出末端是不理想的，改用T4DNA聚合酶或其他的酶是更好的选择。(2)标记DNA3'突出末端(protrudingend)该反应分两步进行：先用3'-5'的外切核酸酶活性除去3'突出末端，产生3'隐含末端，然后在高浓度的标记底物(-32p-dNTP)存在下，使降解(3'-5')作用与聚合(5'-3')作用达到平衡。这种反应也叫交换或取代反应(exchange／replacementreaction)。不过这一反应用T4DNA聚合酶的效果更好，因它的3'-5'外切核酸酶活性较强。(3)其他的一些用途：包括用双脱氧末端终止法进行DNA序列分析、用于cDNA第二链的合成、在定点突变中用于合成第二链、用引物延伸法(primerextension)制备单链DNA探针等。5、细菌碱性磷酸酯酶和小牛肠碱性磷酸酯酶有什么不同？在基因工程中有什么用途？答：主要差别是：CIP68°C时失活，而BAP68°C稳定，且耐酚抽提。应用：(1)dsDNA的5'端脱磷酸，防止DNA的自身连接。但是用CIP处理后，最好将CIP除去后，再进行连接反应。(2)DNA和RNA脱磷酸，然后用于多核苷酸激酶进行末端标记。三、论述题1、如果知道某一基因的功能及其相应的蛋白质的氨基酸序列组成，可以通过何种方法克隆该基因?答：可以通过合成核苷酸探针或设计简并PCR引物从cDNA文库或基因组文库中筛选。或者利用相应的抗体从cDNA表达文库中筛选相应的克隆。作业二：一、名词解释：1、基因工程：在体外将外源基因进行切割并与一定的载体连接，构成重组DNA分子并导入相应受体细胞，使外源基因在受体细胞中进行复制、表达，使目的基因大量扩增或得到相应基因的表达产物或进行定向改造生物性状。简单概括，就是将外源目的基因与载体重组后再进入宿主细胞的过程。2、载体：能载带微量物质共同参与某种化学或物理过程的常量物质，在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。三种最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。3、转化：指将质粒或其他外源DNA导入处于感受态的宿主菌，并使其获得新的表型的过程。4、感染：利用噬菌体将外源DNA导入宿主细胞的方法。5、转导：由噬菌体将一个细胞的基因传递给另一细胞的过程。它是细菌之间传递遗传物质的方式之一。其具体含义是指一个细胞的DNA或RNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中。6、转染：指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。常用的方法有电穿孔法，磷酸钙共沉淀法，脂质体融合法等。二、简答题1、YAC载体具有什么样的功能性DNA序列？为什么在克隆大片段时，YAC具有优越性？答：YAC带有天然染色体所有的功能元件，包括一个着丝粒，一个DNA复制起点，两个端粒。YAC能够容纳长达几百kb的外源DNA，这是质粒和黏粒办不到的。大片段的插入更有可能包含完整的基因，在染色体步移中每次允许更大的步移距离，同时能够减少完整基因组文库所需的克隆数目。2、列举质粒载体必须具备的4个基本特性。答：(1)独立复制；(2)有选择标记；(3)有独特的酶切位点；(4)能转化但不扩散。3、PCR的基本原理是什么？用PCR扩增某一基因，必须预先得到什么样的信息？答：)DNA半保留复制的原理，在体外进行DNA的变性、复性和引物延伸。(2)至少要预先知道足够合成一对引物的靶DNA序列。4、cDNA克隆与基因组克隆有何不同？答：基因组克隆包含所有不在cDNA中出现的内含子。5、怎样将一个平末端DNA片段插入到EcoRI限制位点中去？答：化学合成一些长为10bp含有EcoRI识别位点的短的DNA片段，然后与待克隆片段两端连接起来，如果用EcoRI切割这种连接片段，就会产生EcoRI的单链末端。这种片段就可以插入到任何EcoRI的限制性内切酶位点中。三、论述题什么是Western印迹？它与Southern印迹有什么不同答：Western印迹是将蛋白质经电泳分离后从凝胶中转移到固相支持物上，然后用特异性的抗体进行检测。它与Southern的不同在于探针的性质不同，在Western印迹中使用的探针是抗体(蛋白质)。作业三：一、名词解释1、DNA变性：DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。变性时维持双螺旋稳定性的氢键断裂，碱基间的堆积力遭到破坏，但不涉及到其一级结构的改变。2、DNA复性：变性DNA在适当条件下,二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象,它是变性的一种逆转过程。3、退火：指模板双链DNA经热变性，螺旋解开成单链后，通过缓慢冷却到55℃左右，使引物(即具有互补碱基的RNA片段)与该模板DNA单链重新配对，形成新的双链分子的过程。4、DNA芯片：是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，即可获得样品的遗传信息。由于常用计算机硅芯片作为固相支持物，所以称为DNA芯片。5、错义突变：碱基替换的结果引起氨基酸顺序的变化。6、基因诊断：又称DNA诊断或分子诊断，通过分子生物学和分子遗传学的技术，直接检测出分子结构水平和表达水平是否异常，从而对疾病做出判断。二、简答题1、什么是蓝白斑筛选法？答：这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体。主要是在载体的非必要区插入一个带有大肠杆菌—半乳糖苷酶的基因片段，携带有lac基因片段的载体转入lac的宿主菌后，在含有5—溴—4—氯—3—引哚——D—半乳糖苷(X-gal)平板上形成浅蓝色的噬菌斑。外源基因插人lac(或lac基因部分被取代)后，重组的噬菌体将丧失分解X-gal的能力，转入lac-宿主菌后，在含有5—溴—4—氯—3—引哚——D—半乳糖苷(X-gal)平板上形成白色的噬菌斑，非重组的噬菌体则为蓝色噬菌斑。2、什么是基因文库？用重组DNA技术将某种生物细胞的总DNA或染色体DNA的所有片断随机地连接到基因载体上,然后转移到适当的宿主细胞中，通过细胞增殖而构成各个片段的无性繁殖系（克隆），在制备的克隆数目多到可以把某种生物的全部基因都包含在内的情况下，这一组克隆的总体就被称为某种生物的基因文库。3、黏性末端连接法是最常用的连接方法，具有许多优点，但是也有一些不足，请指出这些不足之处。答：黏性末端连接法不足之处有：(1)载体易自身环化；(2)若是用同一种限制性内切核酸酶产生的黏性末端连接又不易定向克隆；(3)难插入特定的基因；(4)再者就是大片段DNA的重组率较低，即使用碱性磷酸酶处理了载体，防止了载体的自身环化，载体也有成环的倾向；(5)用这种方法产生的重组体往往含有不止一个外源片段或不止一个载体连接起来的串联重组体，增加筛选工作的困难。4、什么是同聚物加尾连接法？用何种方法加尾？具有哪些优缺点？答：所谓同聚物加尾法就是利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3’端各加上一段寡聚核苷酸，制成人工黏性末端，外源DNA和载体DNA分子要分别加上不同的寡聚核苷酸，如dA(dG)和dT(dC),然后在DNA连接酶的作用下涟接成为重组的DNA。这种方法的核心是利用末端转移酶的功能，将核苷酸转移到双链DNA分子的突出或隐蔽的3'-OH上。以Mg2+作为辅助因子，该酶可以在突出的3'-OH端逐个添加单核苷酸，如果用Co2+作辅助因子则可在隐蔽的或平末端的3'-OH端逐个添加单个核苷酸。同聚物加尾法实际上是一种人工黏性末端连接法，具有很多优点：．(1)首先不易自身环化，这是因为同一种DNA的两端的尾巴是相同的，所以不存在自身环化。(2)因为载体和外源片段的末端是互补的黏性末端，所以连接效率较高。(3)用任何一种方法制备的DNA都可以用这种方法进行连接。同聚物加尾法也有一些不便之处：(1)方法繁琐；(2)外源片段难以回收。由于添加了许多同聚物的尾巴，可能会影响外源基因的表达。另外要注意的是，同聚物加尾法同平末端连接法一样，重组连接后往往会产生某种限制性内切核酸酶的切点。5、何谓