04实验四植物DNA的提取及纯度浓度鉴定

植物DNA的提取与鉴定实验四实验原理真核生物DNA与蛋白质结合，以核蛋白的形式存在于细胞核内在提取DNA时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，释放出核蛋白实验原理在浓氯化钠溶液（1～2mol／L）中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很小。在稀氯化钠溶液（0.14mol／L）中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。利用不同浓度氯化钠溶液将DNA核蛋白或RNA核蛋白从样品中分别抽提出来。①在核蛋白溶液加入氯仿－异戊醇，振荡，使蛋白质乳化变性，再离心除去变性蛋白质。②用十二烷基硫酸钠（SDS）等去污剂使蛋白质变性，与核酸分离，从材料中提取出DNA。③用苯酚处理，然后离心分层，蛋白变性后则停留在酚层内。去除蛋白质的方法①化学因素核酸在pH4.0～11.0稳定，否则就变性降解。②物理因素DNA是长链线状分子，强机械作用会使DNA分子断裂。③酶的作用DNA酶会降解DNA分子。破坏DNA完整结构的因素紫外光吸收法鉴定DNA纯度和浓度核酸的紫外吸收峰260nm,蛋白质280nmDNA的A260/A280约1.8，RNA的约2.01ug/mL的DNA溶液,吸光度A260=0.0201ug/mL的RNA溶液，A260=0.022-0.0241.0个A260相当于50ug/mL的DNA,40ug/mL的RNA。实验步骤10mLCTAB分离缓冲液加入50mL离心管中，在65℃水浴中预热。取剪碎的植物叶片适量，置于预冷的研钵中，倒入液氮，尽快将叶片研碎。将约1g叶片粉末加入预热的CTAB分离缓冲液中，轻轻转动混匀，65℃保温30分钟。加10mL氯仿-异戊醇（24：1），轻轻混匀。室温，4000rpm离心10分钟。用一开口较大的滴管将上层水相吸入另一干净的50mL离心管中，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，使核酸沉淀下来用玻璃棒将丝状DNA搅起，转移至10mL70％乙醇中，浸泡洗涤10分钟用玻璃棒取出DNA沉淀，室温下干燥将DNA沉淀溶于0.5mLTE缓冲液中DNA纯度和浓度鉴定取100uLDNA溶液（剩余的DNA溶液放在-20℃保存），用TE缓冲液稀释20，50和100倍，测定A260和A280根据A260/A280判断DNA纯度计算提取的DNA总量试剂CTAB分离缓冲液2%CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）1.4mol/LNaCl20mmol/LEDTA100mmol/LTris-HCL(pH8.0)0.2%巯基乙醇CTABCTAB（十六烷基三甲基溴化铵）阳离子去污剂,它不仅能使蛋白质变性，还能与核酸形成特异的核酸－CTAB复合物。核酸－CTAB复合物可溶于≥0.7mol/LNaCl的高盐缓冲液。异丙醇氯仿-异戊醇（24：1）液氮70%乙醇TE缓冲液10mmol/LTris-HCL（pH7.4）1mmol/LEDTA思考题本实验中CTAB、EDTA、巯基乙醇的作用是什么？吸取样品、抽提应注意什么？为什么？提取DNA时除去蛋白质的方法有哪些？