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实验一质粒的提取（碱法）实验目的1.了解碱法提取质粒的原理；2.掌握碱法提取质粒的方法。实验原理质粒是一种细菌染色体外的、具有自主复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小型DNA分子载体。碱法提取质粒是实验室最常用的质粒提取方法之一，提取量较大，便于操作。这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。载体结构的三大要素：•多克隆位点•选择标记（耐药性，LacZ）•独立的复制起点种类：•质粒•噬菌体•酵母人工染色体（YAC）•反转录病毒载体•表达载体等T-载体在碱性条件（pH12.5）下，线性染色体DNA的双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的氢键虽然断裂但两条互补链彼此缠绕，紧密结合在一起。当加入乙酸钾恢复至中性时，染色体DNA分子难以复性，而质粒DNA分子很快复性，离心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒DNA。本实验采用高纯质粒小量制备试剂盒（离心柱型）提取质粒。本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低PH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高PH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。实验仪器、材料、试剂（一）仪器1.恒温摇床2.超净工作台3.高压灭菌锅4.高速台式离心机5.微量取液器（二）材料含重组质粒的大肠杆菌DH5α菌液。（三）试剂1.SolutionⅠ50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris.·Cl(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)高压灭菌后，4℃保存备用。2.SolutionⅡ(现用现配制)0.2mol/LNaOH1%SDS3.SolutionⅢ（100ml）5mol/LKAc60ml冰醋酸11.5ml水28.5ml配制成的溶液Ⅲ含3mol/L钾盐、5mol/L醋酸（pH4.8）。操作步骤高纯质粒小量制备试剂盒（离心柱型）1．取3.0ml过夜培养的菌液，9000rpm，离心30秒，弃上清，收集菌体，尽可能的倒干上清。处理超过1.5ml菌液可以离心弃上清后，在同一个1.5ml管内加入更多的菌液，重复步骤1，直到收集到足够的菌体。2．用250μl溶液P1重悬菌体沉淀，涡旋振荡至彻底悬浮。如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。3．加250μl的溶液P2，温和地上下翻转6－10次使菌体充分裂解，直到溶液变得清亮。温和地混合，不要剧烈震荡，以免基因组DNA剪切断裂！所用时不应超过5分钟！以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠，如果菌体少，很快清亮粘稠后就可以做下一步。4.加400μl溶液P3，立即温和地上下翻转6-10次，室温放置5分钟。室温13,000rpm离心10分钟，小心取上清。5.将上一步所得上清液加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），13,000rpm离心1分钟，弃滤液。7.加入500μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），13,000rpm离心30-60秒，弃滤液。8.重复步骤7一次，13,000rpm离心30-60秒，弃滤液。空柱13,000rpm离心2分钟。（打开盖子）室温放置3-5分钟，除去残留乙醇。9．取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加20-25μl洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中加热效果更好），室温放置1分钟，13,000rpm离心1分钟洗脱DNA，可立即用于下游分子生物学实验或-20℃保存。洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要质粒浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是体积过小降低质粒洗脱效率，减少质粒产量。