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红细胞血型检测1第二章红细胞血型检测江西医学高等专科学校11级检验班01红细胞血型检测2目录第一节输血前免疫学检查第二节盐水介质试验技术第三节酶处理试验技术第四节抗球蛋白试验技术第五节聚凝胺介质试验技术第六节微柱凝集试验技术第七节吸收放散技术第八节凝集试验技术第九节红细胞血型分子生物学检测技术红细胞血型检测3学习要求：•1.输血前主要包括哪些内容？•2.受血标本接受时的注意事项有哪些？•3.ABO血型和RhD血型鉴定时的注意事项有哪些？•4.交叉配血试验的影响因素有哪些？•5.抗球蛋白试验的临床应用有哪些方面？•6.红细胞血型分子生物学检测技术主要有哪些？红细胞血型检测4第一节输血前免疫学检查目的：是输入的血液成分在受血者的体内发挥其有效作用.在正常情况下，输入的红细胞在受血者体内不溶血，输入的的血浆成分不破坏受血者的红细胞。主要程序：患者的病史和标本等的检查、核对及处理;ABO血型和RhD血型定型；红细胞同种抗体筛查和坚定；交叉配血试验；血小板输注前的抗体检查和配合试验；不规则抗体的筛选和鉴定；交叉配血结果的报告和发血等。红细胞血型检测5一、受血者标本的处理（一）标本的采集输血除了需要达到预期的治疗效果外，必须确保输血安全。血样由临床护士完成，因严格遵守一次只能为一位受血抽取标本，标本不得从输液管或输液侧筋脉中抽取。（二）标本的接收输血科技师接收血样标本时，应认真核对受血者的相关信息，尽可能了解受血者有无输血史、药物史、妊娠史等情况。如果有输血史，这有必要进一步了解最后一次输血的日期，若3个月内输过血，那么供血者的红细胞没有完全代谢消失，可能依然存在于血液循环中，导致血型定型试验中出现混合凝集的结果。红细胞血型检测6（三）标本的要求1.对输血前检查的血液标本应严格要求能代表受血者当前的免疫学状况，标本还需经鉴定和标记，保证其准确无误地来自受血者和供血者，应和血液申请单上的内容一致。2.防止受血者血液标本稀释和（或）溶血，若采集过程中发生溶血则不能使用。3.受血者配血试验对的血液标本必须是输血前3天采集的。4.若受血者使用右旋糖酐、PVP等治疗，应注意洗涤被检红细胞。5.每次输血后，受血者和供血者的标本必须保存于2~8℃至少7天。红细胞血型检测7二、受血者和供血者ABO和Rh定型（一）、原理根据红细胞膜表面上有无A抗原或B抗原，将血型分为A型、B型、AB型、O型4种。A型人血清中含有抗-B抗体，B型人血清中含有抗-A抗体，O型人血清中含有抗-A抗体和抗-B抗体，AB型人血清中不含ABO抗体。正定型：用抗-A及抗-B试剂与被检红细胞反应，检测红细胞表面是否存在A抗原或B抗原。反定型：用标准A细胞及B细胞与被检血清反应，检测血清中是否存在抗体。由于ABO血型系统抗体多数为IgM类，在室温盐水介质中就能出现明显的凝集反应。红细胞血型检测8二、受血者和供血者ABO和Rh定型红细胞血型检测9二、受血者和供血者ABO和Rh定型1.ABO定型最适的反应温度为4℃，但在室温反应良好，所以常规的ABO定型试验仅在室温进行。(1)定型方法：正、反定型的试管离心方法目前仍被认为是最可信赖的ABO定型方法。1)定型试剂：有些ABO血型诊断试剂是以人的血清汇聚而制成的，但必须具备以下条件：第一，高效价(1：128)的IgM抗A或抗B。第二，具较好的亲和性并不含冷凝集素。第三，必需具有检测A2，A2B血型的能力。第四，血清必须通过HIV，HCV，HBV等检查或经病毒灭活。另外一些ABO定型试剂是由来自培养细胞株的单克隆抗体所制成。红细胞血型检测10二、受血者和供血者ABO和Rh定型2)ABO亚型的鉴定：ABO亚型的鉴定通常使用下列试剂：抗A、抗B、抗A1、抗H、抗AIA1红细胞、A2红细胞、B型红细胞和O型红细胞。有些工作者在定型试验中，常规地选择应用抗AB抗血清，以避免错误地把弱反应性A或B型红细胞分类为O型。一般抗AB试剂对Ax型红细胞可增加凝集反应的强度。红细胞血型检测11二、受血者和供血者ABO和Rh定型(一)ABO定型试验中的常见问题：造成这种正反定型不一致的原因主要有：1)技术和管理错误：这是ABO定型中产生异常结果的主要原因，包括：标本或试剂搞错；器材不洁；试剂污染或失效；离心过度或不足；阳性反应产生溶血现象未能识别；漏加试剂；结果记录或判断错误；细胞与血清间比例不适当。2)血清异常：血清蛋白引起缗钱状形成，影响反定型结果。3)红细胞致敏：受免疫球蛋白致敏的红细胞，在含高蛋白介质的试剂中，可发生凝集。4)异常基因型：ABO亚型的检查中，A、B抗原可能为弱抗原，难以检出。红细胞血型检测12二、受血者和供血者ABO和Rh定型5)近期输血：试验前曾输入过其它ABO血型不一致的血液，使血液标本成为混合血型的红细胞悬液，定型时显示“混合外观凝集”现象。6)嵌合体血型：这种血型者体内有两类血型红细胞群体，定型时可以出现“混合外观凝集”现象。7)疾病因素导致抗原减弱：某些白血病患者和难治性贫血患者中，ABO血型系统的抗原性可受到抑制，检出困难。8)红细胞多凝集现象：红细胞因遗传或获得性的表面异常，发生多凝集现象。9)获得性B：由于革兰阴性杆菌的作用，红细胞可获得“类B”的活性。红细胞血型检测13二、受血者和供血者ABO和Rh定型10)血型特异性物质过高：一些卵巢囊肿病例，血型物质的浓度很高，可中和抗A和抗B定型试剂，要得到正确的正定型结果，必须洗涤红细胞多次。11)近期内进行大量的血浆置换治疗：由于使用大量的非同型的血浆作置换治疗，标本血清中含有所输供体提供的抗A或抗B抗体，造成反定型错误。12)异常的血浆蛋白：受检者血浆中异常的白蛋白、球蛋白比例和高浓度的纤维蛋白原等导致缗钱状形成，造成假凝集现象。13)不规则抗体的存在：受检者血浆中，含有ABO血型抗体以外的不规则抗体，与试剂红细胞上其他血型抗原系统的抗原起反应。红细胞血型检测14二、受血者和供血者ABO和Rh定型•14)低丙种球蛋白血症：低丙种球蛋白血症(丙种球蛋白量减低)病例，可能会因免疫球蛋白水平下降而使血清定型时不凝集或弱凝集反应。•15)药物等因素：药物、右旋糖醉及静脉注射某些造影剂可引起红细胞凝集或类似凝集。•16)年龄因素：免疫系统尚未健全的婴儿、由母亲被动获得抗体的婴儿，或抗体水平下降的老人，试验时可出现异常的结果。•17)防腐剂因素：患者体内可能含有对防腐剂中的成分或对混悬介质的抗体，导致ABO定型差错。红细胞血型检测15二、受血者和供血者ABO和Rh定型（二）Rh(D)定型和定型试验中应注意的问题：Rh定型主要鉴定D抗原（IgG抗D和IgM抗D）。Rh系统是最为复杂得多一个系统，涉及临床的主要有D、C、c、E、e五个抗原，其中D抗原的免疫原性最强，仅次于A或B抗原。Rh血型鉴定方法有：玻片法、试管法、微量板法、微柱凝胶法等，试管法最为经典。目前大部分医院都使用微柱凝胶卡式血型鉴定，方法简便快捷，准确度较高。红细胞血型检测16二、受血者和供血者ABO和Rh定型红细胞血型检测17二、受血者和供血者ABO和Rh定型(1)导致Rh血型鉴定可能出现假阳性的原因：•1)受检细胞已被免疫球蛋白致敏，或标本血清中含有引起红细胞凝集的因子。•2)受检细胞与抗血清孵育的时间过长，含高蛋白的定型试剂会引起缗钱状形成。•3)标本抗凝不当，受检过程中出现凝血或小的纤维蛋白凝块，误判为阳性。•4)定型血清中含有事先未被检测的其它特异性抗体，造成假阳性定型结果。•5)多凝集细胞造成定型的假阳性。•6)鉴定用器材或抗血清被污染，造成假阳性。红细胞血型检测18二、受血者和供血者ABO和Rh定型•(2)可能出现假阴性的原因•1)受检细胞悬液浓度太高，与抗血清比例失调。•2)漏加或错加定型血清。•3)定型血清的使用方法错误，没有按说明书进行。•4)离心后重悬细胞扣时，摇动用力过度，摇散微弱的凝集。•5)抗血清保存不当，导致失效。红细胞血型检测19二、受血者和供血者ABO和Rh定型•(三)弱D型(Du型)血型及其鉴定：•Du型抗原是RhO(D)的弱抗原，这种抗原通常与大部分盐水抗D试剂不产生直接凝集反应，而与部分的IgG抗D血型用间接抗球蛋白试验反应阳性。因此当我们初次得到Rh阴性结果时，必须进行作Rh阴性确认试验，即用三种不同批号的IgG抗D定型，如果全部阴性方可认为该被检者为Rh阴性，否则，只要有一批为阳性，则可认为是Du型。•若D人群作为献血者按照RhD阳性对待，其血液只能给Rh阳性受血者输注；作为受血者按照RhD阴性对待，只能接受RhD阴性血液。红细胞血型检测20三、不规则抗体筛选和鉴定一、概念：不规则抗体是指血清中抗-A、抗-B以外的其他血型抗体，也称意外抗体。不规则抗体包括同种抗体和自身抗体。自身抗体：受血者体内产生的抗体，针对自己本身的红细胞抗原。同种抗体：不只针对自身抗原，也会同种异型抗原发生反应。红细胞血型检测21三、不规则抗体筛选和鉴定二、不规则抗体的筛查方法抗体筛选试验的原则是让受检的血清与已知血型的试剂红细胞即筛选红细胞起反应，以发现在37℃中有反应的抗体1.盐水介质法：主要用于IgM类抗体的筛查。优点是：方法简单、操作简单、成本低廉。缺点是：灵敏度低2.聚凝胺法优点：与水盐介质法比灵敏度有所提高。3.抗球蛋白试验：缺点：操作繁琐、工作量大、耗时等。4.酶法：能暴露隐蔽抗原，增强一些稀有抗原检测。但可能会破坏有些抗原，影响检测。目前临床是已不用。红细胞血型检测22三、不规则抗体筛选和鉴定5.微柱凝胶卡式检测法三、不规则抗体的鉴定抗体筛选试验用的试剂筛选红细胞，通常是2或3个人份的O型红细胞成为一套试剂，每套试剂筛选红细胞中至少有以下常见的抗原：D、C、E、c、e、M、N，条件不足的实验室不一定具备Lua、V、Cw、Kpa、Jsa类的抗原。一旦抗体被检出，应作抗体鉴定试验，以确定其特异性。抗体鉴定实验包含以下主要内容：(1)自身细胞检查：观察患者(受者)的血清与患者(受者)自身细胞的反应情况，确定血清内是否有自身抗体或自身抗体和同种抗体二者同时存在。(2)普红细胞：使用试剂细胞中的谱细胞，应用各种抗体检查技术，检测患者的血清，确定其抗体的特异性。红细胞血型检测23三、不规则抗体筛选和鉴定抗体鉴定试验结果的解释及处理：1.与谱细胞反应明显，确定为单一抗体或无法确定为单一抗体，应加以鉴别。2.与谱细胞呈弱反应，结果不明确（1）分析结果：①是否符合剂量效应②谱细胞是否新鲜（2）改变试验方法：①使用高灵敏度的方法重复试验②添加试剂后重复实验③带抗体增强后重复试验红细胞血型检测24三、不规则抗体筛选和鉴定3.与所有谱细胞反应，自身细胞阴性（1）强度不一致：可能存在混合抗体（2）强度一致：抗体可能为专于O细胞反应的抗体（如：抗-I、抗-H、抗-HI）可能针对高频抗原的抗体可能针对谱细胞的抗体4.与所有谱细胞反应，自身细胞阳性（1）存在自身抗体（2）同种和自身抗体同时存在（3）冷凝集：在冷凝集素的作用下存在凝集红细胞红细胞血型检测25三、不规则抗体筛选和鉴定（4）假凝剂：在干扰因子的作用下一可造成红细胞假凝集（5）酶引起的多凝集（6）补体的影响6.与谱细胞不反应，自身细胞阳性可能是自身抗体或C₃阳性红细胞血型检测26三、不规则抗体筛选和鉴定四、抗体筛查和鉴定的影响因素1.抗体筛查和鉴定细胞的质量筛查细胞不包括低频率抗原，不能检出低频率抗原。谱细胞：用于抗体鉴定的试剂红细胞。在选择不规则抗体筛查或鉴定细胞时，应符合本地区不规则抗体分布的特点。2.试验方法法IgM抗体在4℃，凝集强度明显大于室温，37℃会有减弱3.抗体的特异性抗体筛查试验为阴性，并不意味着被检血清中一定没有抗体筛查细胞漏检ABO亚型抗体（如抗-A₁）红细胞血型检测27三、不规则抗体筛选和鉴定五不规则抗体鉴定时遇见的的问题1.不规则抗体筛查阴性，输血后发现溶血（1）交叉配血假阴性（2）抗球蛋白试验不规则抗体筛查假阴性试剂保存不当洗涤不充分实验操作④红细胞浓度过高造成凝集减弱或红细胞浓度过低造成凝集不易被观察到2.