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1绪论引言：植物组织培养是20世纪初开始，以植物生理学为基础，在植物细胞全能性(totipotency)理论的指导下，特别是对植物生长调节剂(growthregulator)的应用而发展起来的一项技术。经过各国科学家100多年的辛勤探索，现在可以说几乎所有的植物，其器官、组织或细胞都能离体培养成功。大多数还能从细胞的一部分，甚至没有细胞壁的裸露的原生质体中，再生出无数的小植株。近40多年来，植物组织培养技术已渗透到生物学科的各个领域，成为生物学科研究的重要技术手段，并在农业、林业、工业、医药业等行业中被广泛应用，产生了巨大的经济效益和社会效益，成为了举世瞩目的生物技术之一。那么，什么是植物组织培养呢？1.植物组织培养的概念和种类1.1植物组织培养的概念植物组织培养的概念有广义和狭义之分。广义的植物组织培养（planttissueculture）是指在无菌和人工预知的控制条件下，利用适当的培养基，对离体的植物器官、组织或细胞进行离体培养，使其再生细胞或生长、分化成完整植株的技术。植物组织培养概念中所提到的无菌(asepsis)是指使培养器皿、器械、培养基和培养材料等处于无真菌、细菌、病毒等微生物的状态，以保证培养材料在培养器皿中正常生长和发育。人工控制的环境条件是指对光照、温度、湿度、气体等条件进行人工控制，以满足植物培养材料在离体条件下的正常生长和发育。适当的培养基是指培养基含2有适当营养物质和植物生长调节物质等。植物组织培养中，使用的各种器官、组织和细胞统称为外植体(explant)。在植物组织培养中，由于培养的植物材料已脱离了母体，故植物组织培养又称为植物离体培养(plantcultureinvitro)。对离体培养环境条件控制的研究内容被称为离体生态学(invitroecology)，其构成是培养基、植物材料和人工环境条件。狭义的植物组织培养仅指对植物的组织（如分生组织、表皮组织、薄壁组织等）及培养产生的愈伤组织（callus）进行离体培养的技术。所谓愈伤组织是指外植体因受伤或在离体培养时，其未分化的细胞和已分化的细胞进行活跃的分裂增殖而形成的一种无特定结构和功能的组织。目前我们一般所说的植物组织培养是指广义的植物组织培养，而最初则指狭义的植物组织培养。1.2植物组织培养的种类植物组织培养最初是指愈伤组织培养。Gamborg曾根据所培养的植物材料的不同，把组织培养分为5种类型，即愈伤组织培养、悬浮细胞培养、器官培养(胚、花药、子房、根和茎的培养等)、茎尖分生组织培养和原生质体培养。但发展至今，其范围日益扩大，已包括植物体和它高度组织化的离体器官、组织、复杂的多细胞和原生质体的离体无菌培养。因此，从培养对象上来看，可将其分成以下几种：1.2.1植株的培养（cultureofplant）植株的培养是指将幼苗及较大植物体放在无菌的人工环境中让3其生长发育的方法。植株培养一般是作为植物组织培养的中间环节，如再生植株的继代培养、壮苗培养等；也用于植物的种质保存，如某些名、优、新或濒危植物的体外慢生长保存。1.2.2胚胎培养（embryoculture）植物胚胎的培养是指将植物成熟或未成熟胚放在离体的、无菌的人工环境中让其生长发育的方法。由于植物的胚是包含在胚珠和子房里，因而进行胚胎培养时，常常是取胚珠和子房放在培养基上，使其内的胚进一步生长发育。胚胎培养的方法也可用于离体受精后形成的杂种胚培养和体细胞诱导出的胚状体培养。1.2.3器官培养（organculture）植物的器官有两类：营养器官和生殖器官。根、茎、叶是植物的三大营养器官，花、种子、果实是植物的生殖器官。植物器官的培养指的是以植物的根、茎、叶、花、种子、果实等器官的组织切块（切块既可是部分器官，也可是部分组织）为外植体，使之在离体的人工无菌环境中进行生长发育的方法。植物器官培养强调的是外植体的器官类别，培养时可用整体器官，也可用器官切块或切段。不同植物的同一器官有不同的培养结果，同一植株的不同器官也有不同的培养结果。这一点在应用植物组织培养技术时相当重要。1.2.4组织培养（tissueculture）植物组织的培养是指将植物体的组织（愈伤组织、分生组织、形成层组织、韧皮韧皮部组织等）或组织切块，放在离体的无菌环境中让其生长发育的方法。由于离体培养的组织块大多是先脱分化形成愈4伤组织，而后再进一步生长分化，因此也将植物组织的培养定义为愈伤组织的培养。1.2.5细胞培养（cellculture）植物细胞的培养是指将植物材料从母体植株上切取后，分离成细胞或小细胞团，放在无菌的人工环境条件下使其生长发育的方法。植物细胞培养强调的培养对象是游离细胞或细胞团，培养时可用一群细胞，也可用单个细胞。1.2.6原生质体培养（protoplastculture）植物原生质体的培养是指将植物的细胞去除细胞壁后形成裸露的原生质体，把原生质体放在无菌的人工环境条件下使其生长发育的方法。其中愈伤组织培养是一种最常见的培养形式。愈伤组织培养之所以是一种最常见的培养形式，是因为除茎尖分生组织培养和一部分器官培养以外，其他几种培养形式最终也都要经历愈伤组织才能产生再生植株。此外，愈伤组织还常常是悬浮培养的细胞和原生质体的来源。根据培养过程，将从植物体上分离下来的部分进行第一次培养，称为初代培养（primaryculture），以后将培养物转移到新的培养基上继续培养，则统称为继代培养(subculture)。根据培养基的物理状态，把加入琼脂使培养基呈固体状态的培养，称为固体培养(solidculture)。不加入琼脂而培养基呈流体状态的培养，称为液体培养(liquidculture)。2.植物组织培养的特点5植物组织培养的主要特点是采用微生物学的实验手段来操作植物离体的器官、组织和细胞。这一特点具体表现在以下几个方面：①无菌：组织培养的整个过程都是在无菌条件下进行的，外植体、培养基、操作器械、接种环境等都须经过无菌处理。②采用人工培养基：组织培养在多数情况下是利用成分完全确定的人工培养基进行的，除少数特殊情况(如进行营养缺陷型突变细胞的筛选)外，培养基中包含了植物生长所需的水分和一切大量元素、微量元素、有机物和植物激素(phytohormone)，培养基的pH和渗透压也是人为设定的。因此，在组织培养中的植物材料不需依靠自身的光合作用制造养分，而是处于完全的异养状态。③离体培养：组织培养的起始材料可以是植物的器官、组织，也可以是单个的细胞，它们都处于离体状态下。细胞的全能性不仅表现在二倍体细胞水平上，而且也表现在单倍体细胞(如小孢子)和三倍体细胞(如胚乳)水平上，即使是去掉了细胞壁的细胞(原生质体)，在组织培养条件下也能再生完整植株。④连续继代培养：组织培养物通过连续继代培养可以不断增殖，形成克隆(clone，也称无性繁殖系)，或通过改变培养基成分，特别是其中的植物激素的种类和配比，而达到不同的实验目的，如茎芽增殖或生根。⑤封闭培养：组织培养是在封闭的容器中进行的，容器内气体和环境气体可通过瓶塞或其他封口材料进行交换。容器内的相对湿度在通常情况下几乎是100％，因此，组培苗叶片表面一般都无角质层或6蜡质层，且气孔保卫细胞功能缺乏，气孔始终都是张开的。⑥人工可控环境条件：组织培养的环境温度、光照强度和时间等都是人为设定的，找出这些物理因素的最适参数对组织培养的成功也很重要。3.植物组织培养有关的基本概念与基础理论3.1植物细胞全能性植物细胞全能性（totipotency）是植物组织培养的理论基础。大家知道，植物细胞和动物细胞在结构上有若干区别，同样地，它们在生理特性上也不完全一样。动物细胞的分化一般都是不可逆的，植物细胞则不然，只要具有一个完整的膜系统和一个有生命力的核，即使是已经高度成熟和分化的细胞，也还保持着回复到分生状态的能力。植物细胞全能性是指一个生活的植物细胞，只要有完整的膜系统和细胞核，它就会有一整套发育成一个完整植株的全部遗传信息，在适当的条件下，这些信息可以表达，再生成一个完整植株。但是在自然状态下，由于细胞在植物体内所处位置及生理条件的不同，它的分化受到各方面的调控，致使其所具有的遗传信息不能全部表达出来，所以只能形成某种特化细胞，构成植物体的一种组织或一个器官的一部分。由此可以说明条件是十分重要的，或者说是关键的，只要条件合适，细胞潜在的遗传能力就会表现出来。植物组织和细胞培养技术就是以细胞全能性作为理论依据，用人为的方法创造出一个适合于生长的理想条件，使细胞的全能性得以发挥。从理论上讲，只要是一个生活的细胞，都有再生出一个完整植株7的潜力，但实际情况并非如此简单。就目前所知，细胞的再生潜力与其分化程度呈负相关，就是说细胞分化程度越高其再生能力越低，但也有人认为细胞的再生能力与其分化程度无关，只是人们现在还没能完全掌握细胞分化的机制。虽然还没有完全从理论上揭示其原因，但事实是越老的细胞，其基因的表达就越受到严格的制约，或者说丧失功能或不表现功能的基因越多，所以应尽量选取幼嫩的植物组织作为培养的实验材料。同时，还应该考虑到，一定的基因型或外植体的再生能力并不是一成不变的，在不同培养条件下，同一基因型或外植体的表现不同，高度分化的细胞或组织只要条件合适，也有产生再生植株的可能，这种可能性能否变为现实，还有待于人们继续努力。3.2细胞分化、脱分化与再分化(celldifferentiation，dedifferentiationandredifferentiation)细胞分化(differentiation)是指生物在个体发育过程中细胞由一般变为特殊的现象，即普通形态结构的细胞，向着不同形态结构的方向发展，从而在机能上也各不相同。受精卵经过细胞分裂和分化，引起极性的形成(根端和茎端)，最后发育成种子，这是一种分化。一粒成熟的种子含有一个小小的胚，也可以叫做胚胎。构成胚胎的所有细胞几乎都保持着未分化的状态和旺盛的细胞分裂能力，其细胞质浓稠、细胞核较大、细胞与细胞之间没有很大差异，这些细胞都可以叫做胚性细胞，或叫分生性细胞或未分化细胞。在适宜的条件下，随着种子的萌发，构成胚胎的所有细胞即开始分裂活动，增加细胞数8目。随着时间的进行，细胞的命运发生不同变化，形态和功能也发生变化，有的形成了叶子的细胞，有的形成了根的细胞，有的形成茎的细胞，有的仍保持分裂能力，有的则逐渐失去分裂能力，这也是分化。分化主要是由细胞内的基因决定的，分化的结果导致细胞分裂能力的丧失，伴随的是细胞的分化、成熟与组织的形成，是植物根、茎、叶、花、果实和种子的形成，是一个成熟植物体的出现。在正常的自然状态下，这些已经分化的细胞不会再恢复分裂能力重新开始细胞分裂，直到植物体死亡为止。当把一个已经失去了分裂能力，处于分化成熟和分裂静止状态的细胞置于特定的增殖培养基上时，它首先发生的变化是回复到分生性状态，这一状态包括由溶酶体的活动而将失去功能的细胞质组分降解，并产生新的细胞质组分（即细胞器的破坏与重建），同时细胞内酶的种类与活性发生改变，蛋白质合成和细胞代谢过程也发生改变，最后引起基因表达的改变，细胞的性质和状态发生了扭转，可以说是返老还童。由失去分裂能力的细胞回复到分生性状态并进行分裂，形成形成一种高度液泡化的呈无定形态的薄壁细胞即愈伤组织的现象（或过程）称为“脱分化”(dedifferentiation)。经过脱分化的细胞如果条件合适，就可以长久保持旺盛的分裂状态而不发生分化。由无分化的愈伤组织的细胞再转变成为具有一定结构，执行一定生理功能的细胞团和组织，进而构成一个完整的植物体或植物器官的现象（或过程），叫做“再分化”(redifferentiation)。一个已分化细胞要表达出其全能性，就要经过脱分化和再分化的9过程，这就是植物组织和细胞培养所要达到的目的。因此,设计培养基和创造合适培养条件的主要原则就是如何促使植物组织和细胞完成脱分化和再分化，培养的主要工作就是设计和筛选培养基，探讨和建立合适的培养条件。植物激素在调节细胞脱分化和再分化中起主要作用。植物对激素的反应十分敏感，培养基中生长素类和细胞分裂素类