1-细胞色素C的制备和含量测定

细胞色素C的制备和含量测定摘要：本实验以新鲜动物心脏为原材料，进行了细胞色素C的制备和含量测定。细胞色素C易溶于水，在酸性溶液中溶解度更大，故可用酸性水溶液提取，利用还原型细胞色素C水溶液在波长520nm有最大吸收值的特征，用分光光度法测定其质量浓度并计算出粗制品的总量。关键词：细胞色素C；制备；含量；测定引言：细胞色素C包括多种能够传递电子的含铁蛋白质总称。广泛存在于各种动植物组织和微生物中。它是呼吸链中极重要的电子传递体，细胞色素C（cytochromec，CytC）只是细胞色素的一种。它在呼吸链上位于细胞色素还原酶和细胞色素氧化酶之间。线粒体中的细胞色素绝大部分与内膜紧密结合，仅有细胞色素C结合轻松，较易被分离纯化。细胞色素C为含铁卟啉的结合蛋白质，每个细胞色素C分子含有一个血红素和一条多肽链。分子质量约为13000，蛋白质部分由104个左右的氨基酸残基组成，其中赖氨酸含量较高，等电点10.2-10.8，含铁量0.37-0.43%。它易溶于水，在酸性溶液中溶解度更大，故可用酸性水溶液提取。本实验以新鲜动物心脏为材料提取制备和纯化细胞色素C，得到其粗品溶液，其中是细胞色素C氧化型和还原型混合物，加入少量联二亚硫酸钠，使混合物中的氧化型转变为还原型，利用还原型细胞色素C水溶液在波长520nm有最大吸收值的特征，用分光光度法测定其质量浓度（mg/ml），并计算出粗制品的总量（mg）。为了解制备蛋白质样品的一般原理和步骤提供实验依据和技术支持。1材料1.1材料新鲜（冷冻）动物心脏样品。1.2试剂（1）25%(NH4)2SO4，12%BaCl2，联二亚硫酸钠。（2）人沸石：白色颗粒，不溶于水，溶于酸。选用40-60目。20%三氯乙酸（TCA）、1mol/LH2SO4（55.5ml/L）、0.2%NaCl、1mol/LNH4OH（67.6ml/L）溶液、细胞色素C标准液（1mg/ml）。1.3仪器绞肉机、电磁搅拌器、离心机、纱布、pH试纸、层析柱（1×10cm）、分光光度计、透析袋等2实验方法2.1材料处理新鲜或冷冻动物心脏，除尽脂肪、血管和韧带，洗尽积血，切成小快，放入绞肉机中绞碎（两遍）。2.2细胞色素C粗品制备2.2.1提取：称取心肌碎肉200克，加自来水300毫升酸化水（水预先用6~8毫升，1mol/L的硫酸酸化）。用电磁搅拌器搅拌提取，再用1mol/L的硫酸调PH=4.0（需要不断调整），搅拌提取1.5小时。用1mol/L的氨水调PH=6.0，停止搅拌。四层纱布挤压过滤，收集滤液。2.2.2中和：用1mol/L的氨水调滤液PH=7.2-7.5，利用等电点沉淀杂蛋白，静置20~30分钟，使沉淀沉下。虹吸上部清夜，过滤除杂质，下部浑浊液离心（3000rpm,15min）。合并得到的红色清液，测量体积。2.2.3吸附：每人称取人造沸石4g，加水搅拌，除去12s内不下沉的细颗粒。向柱内加去离子水至1/2体积，然后边搅拌边连续、均匀地将预处理好的人造沸石水溶液装填入柱，避免柱内出现气泡。装柱完毕，打开柱下端夹子，使柱内沸石面上剩下一薄层水。将中和好的澄清滤液小心加到沸石上面，勿冲动沸石，使之流入柱内进行吸附，控制流出液的速度不超过5ml/min。随着细胞色素C被吸附，人造沸石由白色变为红色，流出液应为淡黄色或微红色。2.2.4洗脱吸附完毕，可在柱内洗涤：依次用30ml自来水、去离子水、0.2%氯化钠溶液、去离子水洗柱。然后用25%硫酸铵溶液洗脱（流速小于2ml/min），收集红色洗脱液（洗脱液一旦变白，立即停止收集），测量体积（控制在10ml左右）。洗脱完毕，人造沸石回收，可再生使用。2.2.5盐析为了进一步提纯细胞色素C，向洗脱液中缓慢加入固体硫酸铵，边加边搅拌，使硫酸铵溶液浓度为45%（约相当于67%的饱和度，即100ml洗脱液加17g硫酸铵），放置过夜，杂蛋白沉淀析出，过滤，收集红色透亮的细胞色素C滤液，测量体积。2.2.6TCA沉淀按8%体积滴加20%TCA，边加边搅拌。此时细胞色素带正电荷，与其结合生成可逆沉淀析出，立即离心（3000rpm，15min）,收集沉淀（若上清液仍为红色，倒出后再补加5%体积的TCA，再次离心，收集沉淀）。沉淀用少量去离子水溶解（体积不超过10mL）。2.2.7透析溶解液装入透析袋对自来水（30min）、去离子水（10~20min）透析（用磁力搅拌器搅拌），用BaCl2检测袋周围水的（用试管收集流下来的透析液约1ml，滴加1-2滴BaCl2试剂至试管中。摇匀若无白色沉淀，表示透析完全）。过滤除去不溶物质，得到细胞色素C的粗品液，量体积，测定其含量。2.3细胞色素C粗品液质量浓度测定2.3.1标准曲线法取1mg/ml标准细胞色素C溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml分别加入6支试管，每管补加去离子水至4ml，加入少许联二亚硫酸钠，摇匀后溶液迅速从深红色转变为桃红色，立即以去离子水为对照在520nm波长分别测出吸光度（注意每一管加入还原剂后应立即比色，即一管一管做，而不是全部加完还原剂后再比色），，取适当稀释的粗品液1ml，加去离子水至4ml，同上方法测出A（使其在标准曲线A范围内），通过标准曲线计算出粗品液质量浓度，或者从标准曲线斜率计算粗品液质量浓度：2.3.2（标准管法）取5支试管按表加入试剂测定：试管编号12345标准液（ml）00.50.500样品液（ml）0000.50.5dH2O3.02.52.52.52.5细胞色素C粗品液质量浓度（mg/ml）=A520nm×稀释倍数斜率还原粉每管加少许联二亚硫酸钠（约3mg），摇匀后立即比色A520nm表中加入细胞色素C粗品液量应根据制品实际浓度高低而定，使其A值能接近标准管的A值，以增加准确性。标准液质量浓度配制成为约1mg/ml。式中，C标准为标准细胞色素C溶液的质量浓度（mg/ml），V标准为标准细胞色素C溶液加入体积（ml），V粗品为粗品液加入体积（ml）。细胞色素C粗品总量（mg）=C粗品×V式中，C粗品为粗品液质量浓度（mg/ml），V为粗品液体积（ml）。3结果表1不同浓度细胞色素C吸光值细胞色素c浓度（mg/ml）00.150.30.450.60.75吸光值00,1150.2450.3880.5140.616图1细胞色素C的标准曲线实验结果测得：A=0.295经计算得样品中细胞色素c的浓度为0.246mg/ml4讨论由上述结果可以看出本次试验中并未充分提取出牛心脏中的细胞色素C。原因可能有以下几点：（1）由于三氯乙酸可引起细胞色素C变性和聚合，所以可通过在沉淀前预先冷却的方法避免其结合后产生不可逆的沉淀析出，减少细胞色素C的损失。（2）细胞色素C粗品质量浓度（mg/ml）=粗品A520nm×C标准×V标准标准溶液A520nm×V粗品细胞色素C的标准曲线y=0.8419x-0.0027R2=0.9981-0.100.10.20.30.40.50.60.700.20.40.60.8标准液质量浓度(mg/ml)吸光度（A)系列1线性(系列1)心脏细胞中含有丰富细胞色素C的线粒体是否破裂与分解取决于酸性强弱。因此在提取过程的溶液酸度可能需要调整至一个更低得点才更利于提取。（3）人为操作所产生的误差导致实验结果不精确。