1实验质粒DNA的制备

实验1碱变性法小量制备质粒DNA一．实验目的及背景质粒是染色体外的DNA分子，大小可为1kb到200kb。大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在。它是细菌内的共生型遗传因子。其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。质粒特点质粒能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞一些表型，是比病毒更简单的原始生命。质粒通过细菌的结合作用，从雄性体转移到雌性体，是细菌有性繁殖的性因子.１９５２年由Lederburg正式命名为质粒。质粒类型质粒按复制方式分为两种类型：松弛型质粒和严紧型质粒1.松弛型质粒松弛型质粒的复制不需要质粒编码的功能蛋白，完全依赖于宿主提供的半衰期较长的酶。即使蛋白质合成受抑制，质粒的复制依然进行。当抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素等抗生素存在时，质粒的拷贝数可达2000-3000拷贝。2.严紧型质粒严紧型质粒复制需要一个质粒编码的蛋白，质粒的拷贝数不能通过用氯霉素等蛋白合成抑制剂来增加。质粒的应用大多数基因工程使用松弛型质粒。严紧型质粒用来表达一些可使宿主细胞受毒害致死的基因。质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。本实验目的本实验要求掌握最常用的质粒的提取方法。分离质粒DNA方法从大肠杆菌中分离质粒DNA方法众多，目前常用的碱变性法；煮沸法；SDS法；羟基磷灰石层析法等各方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性法既经济且收得率较高,提取的质粒DNA可用于酶切,连接与转化。碱变性法基本原理在pH12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态。将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞;分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁,十二烷基磺酸钠(SDS)和TritonX-100可使细胞膜裂解。经溶菌酶和SDS或TritonX-100处理后,细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上,同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多,易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性,而共价闭合环状DNA(CovalentlyclosedcircularDNA，简称cccDNA)的两条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性,而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起,而质粒DNA双链又恢复原状,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解状态存在于液相中。在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状分子,称开环DNA(OpencircularDNA,简称ocDNA)；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂,则形成线状DNA(LinearDNA)。当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。实验试剂ＬＢ培养基：胰化蛋白胨10g酵母提取物5g定容1000mlpH7.5NaCl10gＳＴＥ：0.1MNaCl10mMTrisHCl(pH8.0)1mMEDTAＡｍＰ50mg/ml溶菌酶10mg/ml(用10mMTris·HClpH8.0新鲜配制）试剂溶液Ⅰ：50mM葡萄糖25mMTris·HCl（pH8.0）10mMEDTA溶液Ⅱ：（新鲜配制）0.2NNaOH1%SDS溶液Ⅲ：5MKAC10ml冰醋酸11.5ml水28.5ml酚，氯仿，乙醇RNase琼脂糖ＴＥ：10mMTris-HCl(pH8.0)1mMEDTA溶液Ⅰ50mM葡萄糖/10mMEDTA/25mMTris-HCl，pH=8.0葡萄糖增稠，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA抑制DNase的活性。这一步溶液中还可以加入RNase，不受EDTA影响，并且可以在后续步骤中被除去溶液Ⅱ0.2MNaOH/1%SDS破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。溶液Ⅲ3M醋酸钾/2M醋酸这一步的K置换了SDS（十二烷基磺酸钠）中的Na，得到PDS（十二烷基磺酸钾）沉淀；SDS易与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了，同时基因组DNA也被PDS共沉淀pDC315三．实验方法１．挑取琼脂培养板上的单菌落至5mlLB培养液中（含AmP50μg/ml），３７℃强烈摇荡过度。２．取1.5ml培养液至Eppendorf管中，12000g离心30秒，弃上清，用１mlSTE悬浮菌体，再离心回收菌体，并重复一次，弃上清，取沉淀。３．将细菌沉淀悬浮于100μl预冷溶液Ⅰ中，振荡混匀，冰上放置5分钟。４．加入200μl溶液Ⅱ，盖严管盖轻柔颠倒５次以混匀内容物，冰上放置5分钟。５．加入150μl溶液Ⅲ，温和振荡数次，冰上放置５分钟。６．12000g4℃离心５分钟，取上清移到１个新的Eppendorf管中。(７．加入等体积酚/氯仿（１：１），振荡混匀，12000g4℃离心２分钟。取上清移至另１个Eppendorf管中。)８．加入２倍体积无水乙醇，振荡混匀，于室温静置2分钟。９．１２０００g,4℃离心５分钟。１０．弃上清，加入１ml70%乙醇漂洗沉淀，盖严管盖颠倒数次，１２000g于4℃离心２分钟。１１．弃上清，抽干乙醇，室温干燥（5-15分钟）。１２．加入50μlTE（含20μg/mlRNA酶，不含DNA酶）溶解DNA。13．取10μlDNA溶解液用ＴＥ稀释至1000ul测定OD260和OD280,计算OD260/OD280之比；14.同时以以下公式计算得率。质粒DNA得率：稀释倍数×OD260×0.05×50/1.5ml15．取10μlDNA溶解液加2μlLoadingbuffer于1%琼脂糖,电泳3小时,电压40伏。16．电泳凝胶在透射式紫外检测仪上观察，记录结果。四．结果分析１．质粒DNAOD260,OD280的值，由此计算质粒DNA得率和ＤＮＡ纯度。２．记录电泳结果并说明结果内容。问题与讨论：１．简要叙述溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的作用，以及实验中分别加入上述溶液后，反应体系出现的现象及其成因。２．简要叙述酚氯仿抽提ＤＮＡ体系后出现的现象及其成因。(离心的作用是让它分层，或者说按密度分离。上层水相，有你要的质粒；中间是变性的蛋白；下面是有机相，这样酚氯仿就除去了。)