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1课题1微生物的实验室培养复习目标：1．培养基的种类、营养和配制方法2．无菌技术3．纯化大肠杆菌以及菌种的保藏复习重点：1．无菌技术2．纯化大肠杆菌复习难点：纯化大肠杆菌课时安排：1．5课时【基础知识整合】一、培养基的种类、营养和配制方法1.培养基按照___物理性质___可分为液体培养基和固体培养基。在液体培养基中加入凝固剂___琼脂___后，制成琼脂固体培养基。微生物在固体培养基表面生长，可以形成___肉眼可见___的___菌落___。2.各种培养基一般都含有水、___碳___源、___氮___源和无机盐四种营养物质。满足微生物生长还需要适宜的___pH___(培养霉菌时需要将培养基的pH调至酸性，培养细菌时需将pH调至___中性___或___微碱___性)、氧气的要求(根据微生物的需求提供有氧或无氧环境)、___特殊营养___物质(如培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加___维生素___等)。3.制作牛肉膏蛋白胨固体培养基(1)方法步骤：___计算___、称量、溶化、___灭菌___、___倒平板___。(2)倒平板操作的步骤：①将灭过菌的培养皿放在___火焰旁___的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞。②右手拿锥形瓶，将___瓶口___迅速通过火焰。③用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基(约10～20mL)倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。④等待平板___冷却凝固___，大约需5～10min。然后，将平板倒过来放置，使培养皿盖在下、皿底在上。二、无菌技术1.获得纯净培养物的关键是防止外来___杂菌___的入侵，要注意以下几个方面：①对实验操作的___空间___、操作者的___衣着___和___手___进行___清洁___和___消毒___。②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行___灭菌___。③为避免周围环境中微生物的污染，___实验操作___应在酒精灯___火焰附近___进行。④实验操作时应避免___已经灭菌___处理的材料用具与___周围___的物品相接触。2.消毒与灭菌的区别消毒指使用较为___温和___的___物理___或___化学___方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体___有害___的微生物(不包括___芽孢___和___孢子___)。消毒方法常用___煮沸___消毒法，还有化学药剂(如酒精、氯气、___石炭酸___、___煤酚皂___等)消毒、___紫外2线___消毒。灭菌则是指使用___强烈___的理化因素杀死物体内外___所有___的微生物，包括___芽孢___和___孢子___。灭菌方法有___灼烧___灭菌、___干热___灭菌、___高压蒸汽___灭菌。三、纯化大肠杆菌以及菌种的保藏1.纯化大肠杆菌(1)微生物接种的方法最常用的是___平板划线___法和___稀释涂布平板___法。(2)平板划线法是通过___接种环___在琼脂固体培养基表面___连续划线___的操作。(3)稀释涂布平板法是将___菌液___进行一系列的___梯度___稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到___琼脂固体___培养基的表面，进行培养。分为___系列稀释操作___和___涂布平板操作___两步。(4)用平板划线法和稀释涂布平板法接种的目的是：使聚集在一起的微生物___分散___成单个___细胞___，从而能在培养基___表面___形成单个的___菌落___。(5)平板划线法操作步骤：①将接种环放在火焰上___灼烧___，直到接种环___烧红___。②在火焰旁___冷却___接种环，并打开盛有菌液的试管的棉塞。③将___试管口___通过火焰。④将___已冷却___的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液。⑤将___试管口___通过火焰，并塞上棉塞。⑥左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条___平行线___，盖上皿盖。注意不要划破___培养基___。⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的___末端___开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意___不要___将最后一区的划线与第一区相连。⑧将平板___倒置___放入培养箱中培养。(6)涂布平板操作的步骤：①将___涂布器___浸在盛有酒精的烧杯中。②取___少量___菌液(不超过0.1mL)，滴加到培养基表面。③将沾有少量酒精的涂布器在火焰上___引燃___，待酒精___燃尽___后，___冷却___8～10s。④用涂布器将菌液___均匀___地涂布在培养基表面。2.菌种的保存(1)对于频繁使用的菌种，可以采用___临时___保藏的方法。①临时保藏方法将菌种接种到试管的固体___斜面培养基___上，在___合适___的温度下培养。当菌落长成后，将试管放入___4℃___的冰箱中保藏。以后每___3～6___个月，都要重新将菌种从旧的培养基上___转移___到新鲜的培养基上。②缺点：这种方法保存的时间不长，菌种容易___被污染___或产生___变异___。(2)对于需要___长期___保存的菌种，可以采用___甘油___管藏的方法。在3mL的甘油瓶中，装入1mL甘油后___灭菌___。将1mL培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，放在___-20℃___的冷冻箱中保存。【知识拓展】一、培养基的种类、营养和配制方法1、生物的营养3碳源：能为微生物的代谢提供碳元素的物质。如CO2、NaHCO3等无机碳源；糖类、蛋白质、脂肪等有机碳源。异养微生物只能利用有机碳源。单质碳不能作为碳源。氮源：能为微生物的代谢提供氮元素的物质。如N2、NH3、NO-3、NH+4、蛋白质、氨基酸等。只有固氮微生物才能利用N2。营养是指生物摄取、利用营养物质的过程。营养物质是指维持机体生命活动，保证发育、生殖所需的外源物质。人及动物的营养物质：水、无机盐、糖类、脂质、蛋白质、维生素六类。植物的营养物质：矿质元素、水、二氧化碳等三类。微生物的营养物质：水、无机盐、碳源、氮源及特殊营养物质五类。2.几种微生物的营养能量来源微生物类型碳源氮源能源大肠杆菌糖类、蛋白质等有机物蛋白质等有机物有机物硝化细菌CO2NH3NH3根瘤菌糖类等有机物N2有机物固氮蓝藻CO2N2有机物3.培养基的种类分类方式名称用途按性质分固体培养基分离、记数、鉴定半固体培养基观察运动、鉴定菌种液体培养基生产按营养成分分天然培养基(成分不明)生产合成培养基(成分明确)分类、鉴定按用途分选择培养基分离菌种鉴别培养基(如含伊红和美蓝试剂的培养基可用来鉴别大肠杆菌，菌落呈深紫色，带有金属光泽)鉴别不同种类微生物4.确定培养基制作是否合格的方法将未接种的培养基在恒温箱中保温1～2天，无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。5.平板冷凝后，要将平板倒置的原因平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。二、无菌技术1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还能有效避免操作者自身被微生物感染。培养细菌用的培养基与培养皿、玻棒、试管、烧瓶和吸管需要灭菌；实验操作者的双手需要消毒。2.倒平板无菌操作的注意事项(1)通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。(2)平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。(3)在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，空气中的微4生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，最好不要用这个平板培养微生物。(4)操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。(5)在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线，以免接种环温度太高，杀死菌种。(6)涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。平板划线与系列稀释的无菌操作要求：操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围；等等。三、纯化大肠杆菌以及菌种的保藏1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。我们可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。2.在做第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线，这是因为划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。3.实验后，所有用过的培养基、培养液等都需要统一进行高压蒸汽灭菌后再丢弃，否则将会造成环境污染。【解题】【例1】下列关于细菌的叙述，错误的是(D)A.硝化细菌能以NH3作为氮源和能源物质B.某些细菌可以利用光能固定CO2合成有机物C.特殊营养物质是某些细菌生长过程中需要额外补充的营养物质D.含伊红和美蓝试剂的培养基不能用来鉴别牛奶中的大肠杆菌【例2】下列关于病毒的叙述，正确的是(D)A.烟草花叶病毒可以不依赖宿主细胞而增殖B.流感病毒的核酸位于衣壳外面的囊膜上C.肠道病毒可在经高温灭菌的培养基上生长增殖D.人类免疫缺陷病毒感染可导致获得性免疫缺陷综合症【解题思路探究】【例3】苯酚是工业生产排放的有毒污染物质，自然界中存在着降解苯酚的微生物。某工厂产生的废水中含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株，筛选的主要步骤如图所示，①为土壤样品。请回答下列问题：(1)②中培养目的菌株的选择培养基中应加入___苯酚___作为碳源，②中不同浓度碳源的培养基___A___(A.影响；B.不影响)细菌的数量，如果要测定②中活细菌数量，常采用___稀释涂布平板___法。(2)④为对照，微生物在④中不生长，在⑤中生长，④与⑤培养基的主要区别在于___④的培养基没有加入苯酚作为碳源，⑤培养基中加入苯酚作为碳源___；使用___稀释涂布平板5法或平板划线法___可以在⑥上获得单菌落。采用固体平板培养细菌时为什么进行倒置培养？___采用固体平板培养细菌时要倒置培养，以防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基。___(3)如何比较不同菌株降解苯酚能力的大小？___5支洁净培养瓶→分别加入相同培养基(加等量的苯酚，用pH试纸检测这5支瓶内培养基的pH，用苯酚调试使之相等，苯酚是唯一的碳源)→分别接种5种等量的来自不同菌株的菌种→在相同的适宜条件下培养相同的时间→再用pH试纸检测这5支瓶内培养基的pH。苯酚显酸性，不同菌株的菌种降解苯酚的能力不同，5支瓶内培养基中的苯酚被分解的量不同，所以pH不同。用pH试纸检测这5支瓶内培养基的pH，从而比较不同菌株降解苯酚能力的大小。___(4)实验过程中如何防止其他微生物的污染？___从制备培养基到接种与培养等全部实验过程要无菌操作：略。___【例4】科学家发现家蝇体内存在一种抗菌活性蛋白，这种蛋白质具有极强的抗菌能力，受到研究者重视。(1)分离该抗菌蛋白可用电泳法，其原理是根据蛋白质分子的___电荷(带电情况)___、大小及形状不同，在电场中的___迁移速度___不同而实现分离。(2)可用金黄色葡萄球菌来检验该蛋白的抗菌特性。抗菌实验中所用培养基中的牛肉膏和蛋白胨主要为细菌生长提供___碳源___和___氮源___。(3)分别在加入和未加入该抗菌蛋白的培养基中接种等量菌液。培养一定时间后，比较两种培养基中菌落的___数量___，确定该蛋白质的抗菌效果。(4)细菌培养常用的接种方法有___平板划线法___和___稀释涂布平板法(稀释混合平板法)___。实验结束后，对使用过的培养基应进行___灭菌___处理。【作业】完成《名师导学》对应部分