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细胞原代培养(Cellprimaryculture)实验目的•了解细胞体外培养的原理、基本方法，掌握无菌操作方法及注意事项。•学习观察体外培养细胞的形态及生长状况。实验原理用直接从机体获得的细胞进行的培养称为原代培养。这种培养过程主要是采用无菌操作的方法，把组织（或器官）从动物体内取出，经酶消化处理，使分散成单个细胞，然后在人工条件下培养，使其不断地生长和繁殖。原代培养是建立各种细胞系的第一步。组织块培养法将组织剪成小块后，接种于培养瓶，24小时贴壁后，细胞就从组织周围长出。培养瓶底预先涂以胶原薄层，以利上皮细胞的生长。如需做组织染色或电镜检查，可将组织可放入小盖玻片上后再放进培养瓶培养。换液需轻巧，以免组织块漂起，细胞死亡。消化培养法采用前述的组织消化分散法。将妨碍细胞生长的细胞间质去除，使细胞分散，形成悬液，按不同浓度接种培养瓶培养。实验仪器超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸CO2培养箱倒置显微镜自动双重纯水蒸馏器，纯水仪耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养瓶超净台超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器，除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。滤器滤器工作原理CO2培养箱CO2培养箱设定的条件为37℃，5％CO2。使用CO2培养箱应注意的问题：①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。②保持培养箱内空气干净。定期消毒（90℃，14h)。③箱内无菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。超净台倒置显微镜自动双重纯水蒸馏器纯水仪培养板培养瓶实验材料3龄的乳鼠或乳兔实验试剂（1）1640-RPMI培养液（2）小牛血清（3）青、链霉素（4）PBS液（5）5％NaHCO3（6）75％酒精实验步骤一、培养前的准备工作（1）清洗与消毒（2）配制溶液（3）预热溶液（4）紫外线消毒（5）洗手和着装（6）进入无菌室实验步骤动物细胞原代培养过程图方法与步骤（1）动物处死：将乳鼠用75%酒精浸泡2-3秒至死。（2）取肾及剪肾：在无菌条件下将肾脏取出，置于无菌培养皿中，剪去肾膜和脂肪，用PBS液洗涤1次；放入另一培养皿中，纵向剪开肾脏，去掉肾盂，将肾剪成1mm3大小的块，再并用PBS液洗涤2～3次，直到液体澄清。（3）消化及分散组织块：将上述清洗过的组织放入离心管内，加入5～6倍量的0.25％胰蛋白酶液（pH7.4～7.6），置37℃水浴中消化20～30min，每隔10min摇动一次，直到组织块变得疏松，粘稠，且颜色略变为白色为止。取出离心管，在超净台中吸去胰蛋白酶液，加入5ml培养液，用吸管反复吹打组织块，使其分散成细胞悬液，取上清液至另一离心管中。（4）观察与计数：从细胞悬液中取出1ml滴于载玻片上，显微镜下观察细胞的数目。看到球型的细胞，证明消化下来细胞，实验成功。基本操作技术和要求由于体外培养的细胞没有抗感染能力，因此防污染是决定培养成功的首要条件。一切操作需要保证无菌和有条不紊。