2011 第九章 微生物遗传变异

1第九章微生物遗传和变异目的要求：通过本章的学习，使学生掌握细菌基因重组，真菌基因重组和微生物诱变育种的基本原理和方法。要求掌握：1、细菌基因重组的原理和方法。2、真菌基因重组的原理和方法。3、微生物诱变育种的原理和方法。4、基因工程的基本原理5、基因表达的调控重点：基因突变及修复、细菌的基因重组难点：低频转导，高频转导，准性生殖，基因表达的调控遗传：亲代与子代相似变异：亲代与子代、子代间不同个体不完全相同遗传（inheritance）和变异（variation）是生命的昀本质特性之一遗传型：(genotype)表型：(phenotype)生物的全部遗传因子所携带的遗传信息具有一定遗传型的个体，在特定环境条件下通过生长发育所表现出来的外表特征和内在特征的总和。表型是由遗传型所决定，但也和环境有关。遗传型＋环境条件表型微生物是遗传学研究中的明星：微生物细胞结构简单，营养体一般为单倍体，方便建立纯系。很多常见微生物都易于人工培养，快速、大量生长繁殖。物种和代谢类型多样对环境因素的作用敏感，易于获得各类突变株，操作性强。第一节生物遗传信息的载体1、经典转化实验肺炎链球菌：S型（菌体具荚膜，菌落表面光滑，有致病能力）R型（菌体无荚膜，菌落表面粗糙，无致病能力）一、三个证明核酸是遗传物质的经典实验1928年，F.Griffth的转化实验21944年，Avery的转化实验，确定了转化因子实验证明，将R菌转化为S菌的转化因子是DNA！2、噬菌体感染实验实验证明，进入细菌细胞内部的物质是DNA。DNA包含有产生完整噬菌体的全部信息。32P标记DNA35S标记蛋白质3、植物病毒TMV重建实验实验证明，TMV的遗传物质是RNA。朊病毒的发现和思考:朊病毒蛋白质是遗传物质？？？二、微生物基因组(一）、基因它的物质基础是一个具有特定核苷酸顺序的DNA片段。结构基因：是为细胞结构、组成(如细胞生化反应所需的酶)及完成细胞功能所需的蛋白质等进行编码的基因。调节基因：用于编码调节蛋白的基因。操纵基因：是位于启动子和结构基因之间的一段碱基顺序，能与调节蛋白相结合，以此来决定结构基因的转录是否能进行。重复基因：DNA片段重复跳跃基因：可在DNA上转移位置的基因（IS因子、Tn因子）（二）微生物基因组结构的特点1、原核生物（细菌）的基因组1）染色体为双链环状的DNA分子（单倍体）；2）基因组上遗传信息具有连续性；基因数基本接近由它的基因组大小所估计的基因数一般不含内含子，遗传信息是连续的而不是中断的。3）功能相关的结构基因组成操纵子结构；4）结构基因的单拷贝及rRNA基因的多拷贝；5）基因组的重复序列少而短；一种生物的全部或部分遗传成分的DNA碱基序列称为基因组（genome），它同时包含了基因编码序列和不编码任何基因的DNA序列。32、真核微生物（啤酒酵母）的基因组1）典型的真核染色体结构；啤酒酵母基因组大小为13.5×106bp，分布在16条染色体中。2）没有明显的操纵子结构；3）有间隔区（即非编码区）或内含子序列；4）重复序列多；第一个完成基因组测序的真核生物基因组2、古生菌（詹氏甲烷球菌）的基因组第一个完成基因组测序的古生菌1)只有40％的基因与其他两界的生物有同源性2)古生菌的基因组在结构上类似于细菌1.66x106bp的环状染色体DNA1682个ORF(OpenReadingFrame)3)负责信息传递功能的基因（复制、转录和翻译）则类似于真核生物质粒通常不含有细胞初级代谢的遗传信息,而含有关于次级代谢的遗传信息质粒是独立存在于细菌染色体外或附加在染色体上的遗传物质。它由一共价闭合环DNA分子组成。（三）染色体外的遗传因子1、质粒（Plasmid）1、致育因子(fertilityfactor,F因子)又称F质粒，一种与大肠杆菌的有性生殖现象（接合作用）有关的质粒。由于F因子能以游离状态(F+)和以与染色体相结合的状态(Hfr)存在于细胞中，所以又称之为附加体(episome)。质粒的类型:2、抗性因子(resistancefactor，R因子)主要包括抗药性和抗重金属二大类，简称R质粒。例如R1质粒(94kb)可使宿主对下列五种药物具有抗性：氯霉素(Cm)、链霉素(Sm)、磺胺(Su)、氨苄青霉素(Ap)、卡那霉素(Km)。并且负责这些抗性的基因是成簇地存在于R1抗性质粒上。许多R质粒能使宿主细胞对许多金属离子呈现抗性。43、细菌素质粒Col质粒含有编码大肠菌素的基因4、降解质粒携带有能降解某些物质的酶的基因5、共生质粒携带有与固氮有关的基因6、毒性质粒具有编码毒素的基因7、隐蔽质粒此类质粒不知其特性和表现型，只有通过物理的方法检测其存在质粒的特点：1、能自我复制，稳定的遗传；2、不相容性（incompatibility）同一类型的质粒不能在同一细胞中复制，这种现象被称为质粒的不相容性。3、没有质粒的细菌不能自发的产生质粒,但可以通过转化、转导或接合作用的转移获得质粒；4、质粒可以携带供体细胞的DNA转移。5、可消除性松弛型质粒（relaxedplasmid)：质粒在宿主中可以有10－100个拷贝，也称为高拷贝数质粒。严谨型质粒(stringentplasmid)：质粒在每个宿主细胞中只有1－3个拷贝，也叫低拷贝数质粒。窄宿主范围质粒：质粒的复制起点较特异，只能在一种特定的宿主细胞中复制。广宿主范围质粒：质粒的复制起点不太特异，可以在许多中细菌中复制。2、转座因子转座因子：可自主改变自身座位的DNA片段。插入序列（insertionsequence,IS)转座子（transposon,Tn)某些病毒（Mu噬菌体）原核生物的转座因子：第二节微生物的基因重组一、细菌的基因重组基因重组：指两种不同来源的遗传物质通过转移、交换和重新组合，形成新的基因型的过程。提供部分遗传物质或少数基因的一方称为供体（donor）而获得基因的另一方称为受体（recipient）。如果重组基因在细胞分裂过程中传给子代，则又可能使子代细胞出现新性状，这种菌株称重组体（recombinant）。供体菌受体菌DNA片段转化：指受体细胞在特定生理条件下吸收外源DNA分子或片段，并能表达外源DNA性状的过程。这些被转化的DNA片段称为转化因子。转化后接受外源DNA的受体菌称为转化子（transformant）。（一）转化（transformation)5感受态（competence）：指受体菌细胞昀容易接受外源DNA并使之不被DNA酶降解的生理状态。进行转化，需要二方面必要的条件：1、建立了感受态的受体细胞2、外源游离DNA分子（转化因子）自然感受态的出现是细胞一定生长阶段的生理特性，受细菌自身的基因控制；人工感受态则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNA的能力，或人为地将DNA导入细胞内转化因子通常是双链DNA。转化过程:①感受态的出现②转化因子的吸附与掺入③转化因子的整合转染(transfection)：噬菌体DNA被感受态细胞摄取并产生有活性的病毒颗粒.转染的特点：提纯的噬菌体DNA以转化的（而非感染）途径进入细胞并表达后产生完整的病毒颗粒。人工转化：用CaCl2处理细胞，电穿孔等是常用的人工转化手段。用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一种可以摄取外源DNA的“人工感受态”。电穿孔法（electroporation):用高压脉冲电流击破细胞膜形成小孔，使各种大分子（包括DNA)能通过这些小孔进入细胞，所以又称电转化。（二）转导（transduction）转导：以噬菌体为媒介，将供体菌的部分DNA转移到受体菌细胞中而导致基因重组的过程。细菌转导的类型：普遍转导局限转导转导噬菌体：能将细菌宿主的部分染色体和质粒DNA带到另一个细菌的噬菌体。获得了由噬菌体携带来的供体菌DNA片段的受体细胞称为转导子。在转导中被转移的染色体片段称为转导因子。61、普遍转导（generalizedtransduction）噬菌体可以转导供体菌染色体的任何部分到受体细胞中普遍性转导的三种后果：外源DNA被降解，转导失败。完全转导流产转导完全转导（completetransduction)：进入受体的外源DNA通过同源重组交换而整合到染色体上形成稳定的转导子。转导进入受体细胞的DNA片段不能整合到染色体上，以游离状态存在细胞中，它既不被DNA酶所降解，也不能进行复制，但可以表达所携带的遗传性状。通过细胞分裂，它只能传给一个子细胞流产转导（abortivetransduction）：2、局限转导（specializedtransduction)：指以噬菌体为媒介，只能将供体菌特定的一个或几个基因转移到受体菌中的转导现象。温和噬菌体整合到细菌染色体上宿主细胞发生溶源化溶源菌裂解时，在前噬菌体二侧的宿主基因发生不正常的切割而连在噬菌体DNA上缺陷噬菌体把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中7局限转导与普遍转导的主要区别：a）局限转导中被转导的基因与噬菌体DNA连接，与噬菌体DNA一起进行复制、包装以及被导入受体细胞中。而普遍性转导包装的可能全部是宿主菌的基因。b）局限性转导颗粒携带特定的染色体片段并将固定的个别基因导入受体，故称为局限性转导。而普遍性转导携带的宿主基因具有随机性。（三）接合(conjugation)接合：通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和基因重组过程。结合后的受体菌称为接合子（conjugant）。1946年，JoshuaLederberg和EdwardL.Taturm细菌的多重营养缺陷型杂交实验中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致。证实接合过程需要细胞间的直接接触的“U”型管实验（BernardDavis，1950）接合机制(大肠杆菌的接合机制)接合作用是由一种被称为F因子的质粒介导。F因子的分子量通常为5×107，上面有编码细菌产生性菌毛及控制接合过程进行的20多个基因。F因子为附加体质粒既可以脱离染色体在细胞内独立存在，也可插入（整合）到染色体上F因子的四种细胞形式：a）F-菌株(“雌性”菌株)，不含F因子，没有性菌毛，但可以通过接合作用接收F因子而变成F+菌株；b）F+菌株(“雄性”菌株)，F因子独立存在，细胞表面有性菌毛。c）Hfr菌株，F因子插入到染色体DNA上，细胞表面有性菌毛。d）F′菌株，Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F′因子。细胞表面同样有性菌毛。1）F+×F-杂交1）F+细菌通过性毛与F-细菌接触并发生相互作用；2）F因子出现缺口，双链之一被切断，从断端转移F因子的一条链到F-细菌中。3）F因子的一条链一进入F-细菌中，在F-细菌中复制新的F因子从而变成F+4）原有F+细胞也完成F因子另一条链的复制，所以转移是F+的拷贝。F+＋F+8Hfr菌株的F因子插入到染色体DNA上，因此只要发生接合转移转移过程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给F-细胞并发生重组，由此而得名为高频重组菌株。2）Hfr×F-杂交Hfr菌株仍然保持着F+细胞的特征，具有F性菌毛，并象F+一样与F-细胞进行接合。当OriT序列被缺刻螺旋酶识别而产生缺口后，F因子的先导区(leadingregion)结合着染色体DNA向受体细胞转移。Hfr＋F-3）F′×F-杂交Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F′因子。F′×F-与F+×F-的不同：供体的部分染色体基因随F′一起转入受体细胞a）与染色体发生重组；b）继续存在于F′因子上，形成一种部分二倍体；F′＋F′“接合”“转化”及“转导”这三种在自然界中存在的细菌遗传重组过程各自的特点：外源DNA的来源及进入途径有差异9（四）原生质体融合原生质体融合：将遗传性状不同的两种菌（包括种间、种内、及属间）融合成为一个新的重组子的技术。原生质体融合步骤：1、原生质体制备2、原生质体融合和再生3、融合子的选择二、真核微生物的基因重组能产生有性孢子的酵母菌、霉菌和蕈菌都