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烟草ABF转录因子基因的克隆及功能分析重庆大学硕士学位论文（学术学位）学生姓名：杨玲指导教师：夏庆友教授专业：生物学学科门类：理学重庆大学生命科学学院学院二O一四年四月CloningandFunctionalAnalysisofABFTranscriptionFactorGeneinNicotianatabacumAThesisSubmittedtoChongqingUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementfortheMaster’sDegreeofofScienceByYangLingSupervisedbyProf.XiaQingyouSpecialty:BiologyCollegeofLifeScienceChongqingUniversity,Chongqing,China.April,2014中文摘要I摘要干旱、低温和高盐等是影响植物生长的主要非生物胁迫因素，也是导致作物减产的直接原因，严重的情况下，甚至引起植物死亡。烟草是转基因重要模式生物，也是我国主要的经济作物，对功能基因组研究和经济发展均具有重要意义。在烟草整个生育期，对水分的要求很高，只有在充足的水份供应下，才能确保烟叶的产量和质量。然而在农业生产中，由于地理因素的限制和周期性气候变化，我国烟草农业遭遇了巨大的损失。分离鉴定烟草受非生物胁迫诱导的基因，对揭示烟草抗逆分子机制和烟草抗逆遗传改良均具有重要的意义。ABI5/AREB/ABF转录因子属于bZip转录因子的A亚族，特异存在于植物中，处于ABA信号转导途径的关键位置，功能涉及干旱和激素等逆境信号的传递。ABI5/AREB/ABF转录因子通过与胁迫响应基因启动子区ABRE元件相结合，调控胁迫响应基因表达，提高植物的抗旱性，因此，在非生物胁迫信号传递的过程中，ABI5/AREB/ABF转录因子充当了一个传递开关的作用，在植物抗逆境胁迫过程中具有重要作用。为揭示烟草抗非生物胁迫分子机制，培育优质的基因品种，本研究从栽培烟草“红花大金元”中克隆到2个烟草ABF类基因，NtABF1和NtABF2，并分别从其表达特性、启动子识别特异性、转基因植株抗非生物胁迫能力等方面对基因功能进行综合的评价，为揭示其在植物抗逆境胁迫中的功能和作用机理提供更多参考。主要实验结果如下：①烟草NtABF1和NtABF2基因的克隆及生物信息学分析从烟草品种“红花大金元”中成功克隆到2个ABF基因，NtABF1（GenBank登陆号KF736849）和NtABF2（Genbank登录号KF736850），对NtABF1和NtABF2生物信息学结果表明，NtABF1基因开放阅读框（ORF）长999bp，编码332个氨基酸，蛋白分子量36.45kDa，等电点9.04；NtABF2基因ORF长1305bp，编码433个氨基酸，蛋白分子量46.92kDa，等电点9.35。NtABF1和NtABF2均为含有BRLZ保守结构域的亲水蛋白，不含信号肽与跨膜结构。其高级结构均以α螺旋和无规则卷曲为主，β转角和延伸链含量较少。在亚细胞水平上，NtABF1和NtABF2均定位于细胞核。磷酸化位点分析表明，两蛋白均含有Ser，Thr和Tyr等激酶识别位点。进化分析和多序列比对结果表明，NtABF1与AtAREB3的进化关系最近，序列相似性达54.49%；NtABF2与SlAREB1，StABF1，StABF的亲缘关系较近，序列相似性分别为83.63%，83.52%和83%。功能预测结果显示，NtABF1和NtABF2均为转录调控因子。②烟草NtABF1和NtABF2基因表达模式分析重庆大学硕士学位论文IINtABF1和NtABF2基因组织表达模式分析结果表明，NtABF1和NtABF2表达模式基本一致，在根中相对表达量最高，其次是茎、叶、花，在各组织中，NtABF1相对表达量均高于NtABF2。NtABF1和NtABF2基因逆境表达谱分析结果表明，NtABF2基因表达更易受到各逆境因素的影响：PEG、干旱、NaCl、低温、ABA诱导NtABF2上调表达，MeJA诱导NtABF2下调表达；NtABF1基因受PEG、NaCl、低温、ABA诱导，而干旱、MeJA抑制NtABF1基因的表达。③烟草NtABF1和NtABF2蛋白与ABRE元件体外结合能力分析成功构建了烟草NtABF1和NtABF2基因原核表达载体，pET28a-NtABF1和pET28a-NtABF2，转化表达菌TransRosetta（DE3），诱导目的蛋白表达，纯化目的蛋白，并通过EMSA实验体外检测目的蛋白分别与C-box及G-boxABRE元件结合能力，电泳结果表明，NtABF1和NtABF2蛋白均能特异识别并结合C-boxABRE元件，NtABF2与C-boxABRE元件结合信号较强，当适当提高NtABF2蛋白浓度后，能够检测到NtABF2与G-box元件特异结合信号。④烟草NtABF1和NtABF2过表达转基因株系的获得及功能鉴定成功构建了烟草NtABF1和NtABF2基因植物过表达载体pCXSN:35S:NtABF1和pCXSN:35S:NtABF2，转化农杆菌LBA4404，叶盘法转化烟草，PCR筛选获得NtABF1和NtABF2阳性转基因株系各19株。控水处理30天后，对pCXSN:35S:NtABF1基因转基因株系7#、8#、10#及pCXSN:35S:NtABF2基因转基因株系11#、14#、17#目的基因（NtABF1或NtABF2）及逆境诱导基因定量分析结果显示，pCXSN:35S:NtABF1过表达转基因株系7#、8#、10#中NtABF1基因表达量显著高于对照，且株系7#和8#中，NtAPX及NtERD10C表达量升高，而在这三个株系中，NtNCED1基因的表达均受到抑制，推测这三个株系可能通过其他的逆境响应途径如ROS清除，诱导抗逆蛋白的表达等途径增强转基因植株的抗逆性；pCXSN:35S:NtABF2过表达转基因株系17#叶片中NtABF2、NtAPX和NtNCED1基因显著高于对照，而11#、14#和17#这三个株系中NtERD10C表达量均比对照低，可初步推测推测NtABF2T0代过表达株系17#综合抗逆性优于11#和14#。关键词：ABF转录因子，ABRE元件，表达模式，凝胶阻滞实验，抗逆性英文摘要IIIABSTRACTDrought,lowtemperatureandhighsalinityaremainabioticstressfactorswhichinfluenceplants’growthandaredirectcausesleadingtocroplosses,tosomesevereextent,willresultinplants’death.Asanimportanttransgenicmodelorganismandmaineconomicalcropsofourcountry,tobaccoholdvaluablesignificanceforfunctionalgenomicsresearchandeconomicdevelopment.Tobaccohasahighrequirementforwaterduringthewholegrowthperiod.Onlyunderadequatewatersupply,thequantityandqualityoftobaccoleavescanbeassured.Whileinagriculturalproduction,tobaccoagricultureofourcountrysufferedhugelossesduetotherestrictionsofgeographicalfactorsandperiodicclimatechange.Isolationandidentificationtobaccoabiotic-inducedgeneshasvaluablesignificanceforrevealingtobaccoadverse-resistancemolecularmechanismsandtheartoftobaccogeneticimprovements.ABI5/AREB/ABFtranscriptionfactorsbelongtoAsubfamilyofbZiptranscriptionfactors,theyspecificallyexistinplants.TheyareinacriticalpositioninABAtransductionpathwayandtheirfunctionsinvolvesignaltransductionfordroughtandhormone.ABI5/AREB/ABFtranscriptionfactorsrecognizeandbindtoABREelementofstress-responsivegenes’promoter,improveplantsdroughtresistancebyregulatingstress-relatedgeneexpression.therefore,ABI5/AREB/ABFtranscriptionfactorsactsasatransmissionswitchinabioticsignaltransductionprocess,playinganimportantroleinplantadversityresistance.Torevealtobaccomolecularmechanismofabioticresistanceandcultivatehigh-qualitytobaccovarieties,wehadsuccessfullyisolatedtwotobaccoABFgenes,NtABF1andNtABF2,andmadeacomprehensiveevaluationincludingtheirexpressionprofiles,therecongnitionspecificityofpromotersandthecapacibilityofabioticresistanceoftransgenicplants,toprovidemorereferencesforrevealingtheirroleandactionmechanisminplantadversityresistance.Themainresearchresultsareasfollows:①CloningandbioinformaticsanalysisoftobaccoNtABF1andNtABF2geneWesuccessfullyclonedtwoABFgenes,NtABF1(GenBankaccessionnumberKF736849)andNtABF2(GenBankaccessionnumberKF736850),fromtobaccocultivar“honghuadajinyuan”.Bioinformaticsanalysisresultsindicatethat,thefulllengthofNtABF1Openreadingframe(ORF)is999bp,encoding332aminoacidswhosemolecularweightis36.45kDaandtheoreticalisoelectricpointpIis9.04;Thefulllength重庆大学硕士学位论文IVofNtABF2ORFis1305bp,encoding433aminoacidswhosemolecularweightis46.92kDaandtheoreticalisoelectricpointpIis9.35.BothNtABF1andNtABF2arehydrophilicproteinsholdingBRLZ