1 吸量管和移液器的使用、校正与数据处理

吸量管和微量可调式移液器的使用、校正与数据处理（Volumetransfer,accuracyandprecision）李志红Office:S-2514;Tel:[phone](office)Email:[e-mail]生物化学基本实验技能训练（一）实验目的•了解生物化学实验室规章制度和实验要求•掌握刻度吸管的分类和使用方法，达到稳、捷、准•掌握微量可调式移液器的原理和使用方法，了解可调式移液器的校正方法•建立实验误差、准确度和精确度的概念，掌握误差分析计算方法•了解电子天平的使用方法生化实验室规章制度和实验要求1.必须按教学计划规定的时间到实验室，不迟到，不早退。进入实验室必须穿实验服。2.保持环境的肃静和整洁，不高声说话，严禁用器械及动物开玩笑。3.严格按操作规程使用仪器，凡不熟悉操作方法的仪器不得随意动用。仪器发生故障、损坏、丢失时，应立即报告老师，凡违反操作规程而损坏仪器者，要追究责任。4.实验过程中要大胆、细心，认真观察实验现象并记录好原始数据；节约试剂，节约水电。5.实验完毕，洗净所用器材，固体舍弃物(如用过的滤纸、电泳用凝胶条等)切勿倒入水槽内，以免堵塞。须经指导教师同意，方能离开实验室。6.值日生负责实验室卫生，倒尽垃圾，关好水、电、门窗，经教师检查后方可离开。试剂使用1.仔细辨认标签，确定所需试剂及浓度。2.吸量管与所需试剂号码务必对准。3.用后盖好瓶盖(切勿张冠李戴)归还原处，以免影响他人使用。实验考核•生化总成绩–理论考试卷面成绩(60%)–实验成绩(30%)–平时成绩(10%)•实验成绩–平时实验成绩(60%)–实验考试成绩(40%)平时实验成绩•三部分：考勤(20%)+实验操作(40%)+实验报告(40%)–考勤：迟到，扣10分；旷课，本次实验成绩为0分–操作：•不穿白大褂扣10分，•不带实验教材扣10分。•没有预先预习实验扣10分。•实验操作不规范扣5分；•过失造成玻璃器皿损坏扣5分；•过失造成仪器损坏扣10分。•没有清洗玻璃器皿和还原仪器原状扣10分。•没做清洁扣10分。实验报告的书写•实验报告–没有实验目的扣5分–没有实验原理扣5分–没有实验过程扣10分，尽可能用图、表来表示–涂改实验数据扣20分。–没有分析与实验讨论（或者思考题）扣15分–没有报告临床意义扣5分–态度（书写、条理、通顺）•预习报告（每次实验课前检查）–实验目的、原理、试剂、操作步骤和临床意义本学期实验内容1刻度吸管、可调式移液器的校正与误差分析2分光光度法测定物质的浓度3血清总蛋白和白/球比值的测定4酶的竞争性抑制5血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离6血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳7血清碱性磷酸酶活性测定8血糖测定9质粒DNA的提取10DNA的琼脂糖凝胶电泳分析11血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性测定12直接胆红素与总胆红素测定13实验考试生物化学课程网站•访问路径：“三峡大学”-“求索学堂”-“课程总揽”-“医学院”-“医用生物化学”•网站内有理论课和实验课的教学大纲、ppt，习题集，考试方法和考试样卷等，同学们可根据需要下载学习刻度吸管和微量可调式移液器的使用、校正与误差分析问题：将一定量的溶液从一容器转移到另一个容器。用什么量具？是否精准？一、刻度吸管(pipette)的分类和操作方法•分类：–10ml,5ml,2ml,1ml,0.5ml,0.2ml,0.1ml（吹?）移液管吸量管刻度吸管的操作方法1．使用前：首先要看刻度吸管标记、刻度标线位置等。2．吸液：用右手的拇指和中指捏住刻度吸管的上端，将管的下口插入欲吸取的溶液中；左手拿洗耳球，将洗耳球内空气排出，接在管的上口把溶液慢慢吸入至刻度以上，立即用右手的食指按住管口。3．调节液面：将刻度吸管向上提升离开液面，略为放松食指（有时可微微转动吸管）使管内溶液慢慢从下口流出，直至溶液的弯月面底部与标线相切为止（看刻度时，应将刻度吸管的刻度与眼睛平行），立即用食指压紧管口。将尖端的液滴靠壁去掉，移出刻度吸管，插入承接溶液的器皿中。4．放出溶液：刻度吸管下端紧靠锥形瓶内壁，稍松开食指，让溶液沿瓶壁慢慢流下，流完后管尖端接触瓶内壁停留数秒后，再将刻度吸管移去；若刻度吸管上标有“吹”，则需将管内残余液体吹出。法国GILSON芬兰Labsystems日本NICHIRYO美国TOMOS德国Brand德国Eppendorf美国JENCONS芬兰雷勃Finnpipette工欲善其事，必先利其器二、微量可调式移液器（micropipette,俗称“加样枪”）的构造和使用方法微量可调式移液器的规格•用途•规格：–5ml移液器(1000-5000ul)–1ml移液器(200-1000)–200ul移液器(20-200)–100ul移液器(20-100ul)–10ul移液器(0.5-10ul)–2ul移液器(0.1-2ul)移液器及配套吸嘴（俗称枪头，tip）0.5-20µl20-200µl100-1000µl1.5ml0.2ml2ml移液器常用的盛接容器•酶标板•离心管微量可调式移液器的构造•扭动转轴，即可调整和改变移液器容量•手指把手•吸头的排出器•容量指示•吸头排出器套筒•吸头圆锥体微量可调式移液器的原理•1956年，由德国生理化学研究所的科学家Schnitger发明.–活塞冲程加样–活塞冲程(空气垫)加样器的结构是空气垫、活塞。空气垫的作用是将吸于塑料吸头内的液体样本与加样器内的活塞分隔开来；活塞在加样器内作弹簧样运动，通过空气垫带动液体进入吸头中。移液器的操作方法-1•1.量程的调节：千万不要将按钮旋出量程以外（！！！），否则会卡住内部机械装置而损坏了移液枪。(a):P-20Model6.86ml(b):P-200Model132.4ml(c):P-1000Model262ml移液器的操作方法-2•2.枪头（吸头）的装配•将加样枪垂直插入枪头（pipettetips）中，稍微用力左右微微转动即可使其紧密结合。•注意：不要使劲地在枪头盒子上敲，这样会导致移液枪的内部配件（如弹簧）因敲击产生的瞬时撞击力而变得松散，甚至会导致刻度调节旋钮卡住。Exampleoftipsizes:移液器的操作方法-3•3.吸液吸取液体前，先用大拇指将按钮按下至第一停点，移液器保持竖直状态，将枪头插入液面下2－3毫米。然后慢慢松开按钮回原点，取出加样枪。移液器的操作方法-4•4．放出溶液将加样枪加入盛接溶液的器皿中，将按钮按至第一停点排出液体，稍停片刻继续按按钮至第二停点（终点）吹出残余的液体。最后松开按钮。(a)StartDispensing(b)1stStop=Dispense(c)2ndStop=Expel移液器的操作方法-5•5.弃枪头按下加样枪上的枪头推出杆，将枪头打入指定位置。Pressejectorbuttontodiscardtip.移液器的完整操作步骤•1.量程的调节：千万不要将按钮旋出量程（！！！），否则会卡住内部机械装置而损坏了移液枪。•2.枪头（吸头）的装配将加样枪垂直插入枪头（pipettetips）中，稍微用力左右微微转动即可使其紧密结合。不要使劲地在枪头盒子上敲，这样会导致移液枪的内部配件（如弹簧）因敲击产生的瞬时撞击力而变得松散，甚至会导致刻度调节旋钮卡住。•3.吸液吸取液体前，先用大拇指将按钮按下至第一停点，移液器保持竖直状态，将枪头插入液面下2－3毫米。然后慢慢松开按钮回原点，取出加样枪。•4．放出溶液将加样枪加入盛接溶液的器皿中，将按钮按至第一停点排出液体，稍停片刻继续按按钮至第二停点（终点）吹出残余的液体。最后松开按钮。•5.弃枪头按下加样枪上的枪头推出杆，将枪头打入指定位置。注意事项•移液器的正确放置当移液器枪头里有液体时，切勿将移液器水平放置或倒置，以免液体倒流腐蚀活塞弹簧。•维护保养时的注意事项（1）如不使用，要把移液枪的量程调至最大值的刻度，使弹簧处于松弛状态以保护弹簧；（2）最好定期清洗移液枪，可以用肥皂水或60％的异丙醇，再用蒸馏水清洗，自然晾干。（3）校准是可以在20-25度环境中，通过重复几次秤量蒸馏水的方法来进行。三、实验结果的数据处理（AccuracyandPrecision）•概念：–准确度(accuracy)：绝对误差、相对误差–误差（error）：系统误差、偶然误差–精确度（precision)–偏差（deviation）：绝对偏差、相对偏差、标准偏差（一）准确度和误差（Accuracyanderror）1.定义•准确度（Accuracy）：分析结果与真值相接近的程度–准确度的高低用误差表示•误差（error）：测定结果（X）与真实值（XT）之间的差值•系统误差影响准确度的高低2.表示方法:绝对误差和相对误差•绝对误差（Absoluteerror）：E=X-XT•相对误差（Relativeerror）:100%rTEEX系统误差•由于分析过程中某些固定的原因所造成的误差.1.性质（1）单向性、重复性（2）与测定次数无关（3）可以校正，大小、正负可以测定2.产生的原因（1）方法误差（2）仪器和试剂误差（3）操作误差（4）主观误差3.校正：改变方法，校正仪器，采用高等级试剂等偶然误差1、性质：（1）大小可变（2）方向不定，有时正、有时负。（3）只能减小，不能消除。2、产生的原因：温度、气压、湿度、仪器性能的微小改变、人为的终点判断的变化等。3、校正：不能消除，只有增加平行实验次数（二）精密度与偏差(precisionanddeviation)1.定义:•精密度:在相同条件下,各次分析结果相互间接近的程度.–精密度的高低用偏差表示.•偏差:测定结果（X）与平均值（）之间的差值–偏差小,表示数据集中,精密度高;反之,数据分散,精密度低.–偶然误差影响分析结果的精密度.X（二）精密度与偏差(precisionanddeviation)2.表示方法:(1)绝对偏差和相对偏差:绝对偏差(absolutedeviation,di)：di=单个测量值(Xi)－平均值()相对偏差(relativedeviation,dr)：Mean:X=nxxxn21X100%irddX(2)标准偏差(standarddeviation，SDorS)相对标准偏差(RelativeStandardDeviation,RSD)，又称变异系数(CoefficientofVariation,CV)%100XSCVThreetargetswiththreearrowseachtoshoot.Canyouhitthebull's-eye?BothaccurateandprecisePrecisebutnotaccurateNeitheraccuratenorpreciseHowdotheycompare?体积准确度（平均误差）精确度（重现性）ul误差（ul）误差（％）S.D.（ul）R.S.D.（ul）P202±0.1±5.0≤0.03≤1.55±0.1±2.0≤0.04≤0.8010±0.1±1.0≤0.05≤0.5020±0.2±1.0≤0.06≤0.30P10020±0.35±1.8≤0.10≤0.550±0.40±0.8≤0.12≤0.24100±0.80±0.8≤0.15≤0.15P20050±0.5±1.0≤0.20≤0.40100±0.8±0.8≤0.25≤0.25200±1.6±0.8≤0.30≤0.15P1000200±3±1.5≤0.60≤1.30500±4±0.8≤1.0≤0.201000±8±0.8≤1.5≤0.15移液器的准确度与精确度微量可调式移液器系统误差的校正•校准方法？•必须考虑的环境与仪器的影响因素？–温度、湿度、天平的精度、水的纯度等•如何消除偶然误差的影响？电子天平•用电磁力平衡被称物体重力的天平称之为电子天平。•它是传感技术、模拟电子技术、数字电子技术和微处理器技术发展的综合产物，具有自动校准、自动显示、去皮重、自动数据输出、自动故障寻迹、超载保护等多种功能。•电子天平的心脏-重力电磁传感器