生物发光和化学发光在生物技术中的应用

生物发光和化学发光在生物技术中的应用最近的一些分子生物学进展使得一些生物技术工具极大提高了生物发光和化学发光的检测和快速应用。这些发展方便了体外和体内持续检测生物过程（如基因表达，蛋白质－蛋白质相互间作用和疾病的进程），可应用于临床、诊断、和药物开发等。而且，结合发光酶或某些在基因水平有生物特异结合位点的发光蛋白发展了超敏感和选择性的生物分析工具，如重组细胞生物传感器，免疫分析和核酸杂交系统。发光分析信号的高度可侦测性使得它非常适合于微小化的生物分析装置（如微矩阵，微流设备和高密度的微孔板）以用于小量样品体积的基因和蛋白的高通量筛选。自从20多年前，MarleneDeLuca’s第一个成功的获得表达萤火虫荧光素酶基因（luc基因）的转基因烟草以来，生物发光的应用进入了一个新时代。生物发光和化学发光（BL/CL）的主要特点就在于发光信号的高度可测性，可以用PMT（光电倍增管）和CCD成像系统来检测极少量的光子信号。BL是属于CL范畴之内，CL反应的特点是高光子产生效率，BL为05-0.8，CL为0.1-0.001。因此BL/CL的检测极限可以达到10－18到10－21摩尔，这显然要比其它的光学技术强的多。BL/CL已经发展出了很多具体的分析方法来诊断目前微摩尔或纳摩尔级的生物样本。通过BL/CL结合酶反应，如氧化酶、脱氢酶和激酶等，就可以达到如此的检测灵敏度。然而，以发光技术为基础的分析主要还仅仅停留在作为一个诊断工具。如果BL/CL的潜能能够得到开发，那么许多稀有的微量样品也可以通过一个便宜、可靠甚至是点对点的方式进行测量。分子生物学和生物技术持续地进展产生了一些新的BL/CL试剂，包括重组和突变酶及相关基因，可以作为报告剂或探针。这些工具的获得，再加上新的CL高效底物，促进了革新性的生物分析技术的出现，用于许多靶标的超敏感检测。新的BL/CL生物技术工具新的BL/CL报告基因报告基因技术代表了分子生物学最近主要的进展之一。报告基因是一段DNA序列，编码一个很容易被侦测到的蛋白或酶。它们可以人工引入到一个细胞内来监测基因的表达，以得到整体细胞生物传感器或细胞定位的作用。报告基因技术应用到研发BL/CL全细胞生物传感器的原理如图1a。目前，细菌荧光素酶基因（如陆上的Photorhabdusluminescens和海洋中Vibrioharveyi细菌的lux基因），真核的来自于萤火虫Photinuspyralis和海参Renillareniformis的luc和ruc基因是广泛应用的BL报告基因。此外，一些新的基因cDNAs也已克隆和表达。有意思的是一些新的基因，如那些能够发射红光和绿光的Phrixothrixhirtus荧光素酶，各种突变的发不同波长光的萤火虫荧光素酶。不同的荧光素酶的特性如表1。此外最近克隆和纯化的重组辣根过氧化物酶（HRP）成为一个新的生物技术工具，在不久的将来有较大的期待。实际上，高效的HRP的底物已经商业化。HRP是与CL检测组合应用最广泛的酶之一。双报告基因系统在多重发光测试中，信号是同时产生，测试是独立进行。可以测试不同的发光动力学反应或不同的发射光波。可选择的是，反应也可以按顺序被促发，如商业化的Promega公司提供的Renilla和Firefly荧光素酶双报告基因试剂。双报告系统的原理如Figure1b.双重分析的BL/CL分析采用连续的闪烁型（Flash）发光形式，如发光蛋白水母蛋白和acridinium-9-carboxamide标记。这种方法可以在一个反应管里定量两个分析物和测试两个发光反应。因为它建立在flash型的发光上，分析测试需要非常短的时间，所以适用于高通量的筛选。图1.新的生物技术工具。(a)利用报告基因技术研发的生物发光和化学发光(BL/CL)全细胞生物传感器。一个被分析物质或者刺激会特异性的激活控制基因表达和蛋白合成的调控序列，再利用BL/CL技术进行检测。(b)双报告系统。控制蛋白的信号会组成性的表达，以作为一个内部参照，对以来于被分析物／刺激的信号进行校正以减小实验变异；另一种方式是在同一系统中，使用两个基因同时或先后检测两种分析物。(c)一个报告基因蛋白与一个结合蛋白融合形成BL/CL双功能融合蛋白。(d)包含有相应结合蛋白（如MagA蛋白）的融合蛋白可以被细菌磁性颗粒特异性捕获。BL/CL双功能分子目前已有报道，一个双功能的分子既可以作为萤火虫荧光素酶的底物，又可以作为HRP的底物。通过这种方法，因为不同的发光光谱，就可在同一个反应孔中可以用两个酶标记并独立测试。通过编码BL酶的基因或发光蛋白基因与第二个基因（编码结合蛋白，如蛋白A，蛋白G，链霉亲和素，或生物素受体肽）形成融合蛋白可以广泛用于免疫分析或免疫印迹，如图1c。表1.不同组织中生物发光系统的特性细菌磁性颗粒（BacterialMagneticParticles，BMPs）一个新的有趣的方法是基于磁性细菌Magnetospirillummagneticum建立的细菌磁性颗粒（BMPs）。通过融合蛋白技术，在细菌表面BMPs展示了其特异的蛋白性能。这个生物技术工具，组合了磁性和生物特异结合特性，可以应用于全自动的CL免疫分析，也可用于核酸的纯化和分析。生物发光共振能量转移（BioluminescenceResonanceEnergyTransfer）最近，人们把注意力集中到了活细胞的共振能量转移（RET，resonanceenergytransfer）技术上。利用这种方法可以非侵入性地监测特异蛋白质－蛋白质之间的相互作用。这些技术是建立在能量转移的基础上，在一个发光或荧光供体和一个荧光受体（如绿色荧光蛋白的突变体GFP）之间会发生能量转移。例如，在一些海洋生物（如水母Aequoreavictoria和海参R.reniformis）中自然发生一种能量转移现象――生物发光共振能量转移。在这个过程中，Renilla的荧光素酶（Rluc）在有底物腔肠素的存在下能够发出蓝光（480nm），能够转移能量到GFP的突变体上[增强的黄色荧光蛋白(EYFP)],随之后者发出530nm的绿光。这两个蛋白的相互作用可以通过Rluc融合蛋白和EYFP融合蛋白两者的相互关系来进行评估。它们间的能量转移只有在Rluc和EYFP的两个融合蛋白接近到足够近（100A°）的距离时才能发生。BRET的信号可以通过比较EYFP发出的绿光和Rluc发出的蓝光的量来进行测量。因为BRET信号是一个比率数，不是一个绝对量，它消除了那些因为由于细胞数、细胞类型和其它实验变量而引起的数据变量。图2.生物发光共振能量转移(BRET)监测蛋白－蛋白互作。这个方法已成功地应用于活细胞中受体二聚体形成（如胰岛素受体）和受体间相互作用等研究中。BRET也是一种灵敏地检测方法，可以应用于活细胞内转录激活核蛋白相互作用等研究中。虽然BRET和FRET特别适合于高通量筛选，被使用于药物开发中，但是此技术目前因为关系到供体和受体间的距离障碍，所以还是有一些缺点。向微型化分析的方向发展小型化分析设备，如微矩阵和微流装置，已经得到充分的发展，同时不同的，基于传统的小规模分析的方法也得到进一步发展，如微孔板。微矩阵通过荧光检测的核酸微矩阵（基因芯片）是已经成熟建立的分析工具，它革命性地推进了基因分析和医学诊断。因为任何类型配体结合的相互作用（如抗原－抗体，蛋白质－蛋白质，配体－受体）都可以利用蛋白微矩阵，所以蛋白微矩阵越来越成为一种普遍的医学研究、诊断、蛋白组学和药物开发的工具。现在已经发展了一种CL微矩阵，它是把单克隆抗体点到传统的96孔微孔板的孔底，可以用传统微孔板处理装置来检测细胞因子。最近，每平方厘米包含上千个分子探针的大规模的微矩阵已研发出来，用于免疫检测一些蛋白。多点技术原来就可以点生物特异性的探针和样品于一固体支撑物上，使得可以在一个平面上而无需孔或管来分离样品进行多个免疫分析（即在多个样品中同时检测多个分析物）。芯片实验室(Lab-On-A-Chip)微流装置，通常也称之为芯片实验室或微分析系统，包括蚀刻在合适固体上的流体通道（它是用于快速系列处理分析样品）。最近发展出了大量的CL微流体分析系统，它们有基于固定化酶，抗体或核酸。虽然一次只能分析处理一个样品，但是因为它们的小型化，通过组合多个装置可以提高通量平行分析多个分析测试。因为CL分析仅需要小量样品并且是低密度，所以微小化的CL分析装置设计时对光的收集就已最大化，如利用光纤，或尽可能地把CL检测器方放到接近样品地地方，甚至通过微技术嵌到分析装置上。虽然最近发展的一些基于矩阵的多功能生物芯片包含酶、抗体或核酸到多层和依赖于化学发光和电化学发光检测，这些能够同时进行一定量的多分析物分析测试。小型化微孔板通过从传统的96、384和1536微孔板增加孔数可以增加微孔板的微孔密度（图3）。纳升容量的微孔板也可以设计出高度平行分析，如BL的ATP分析。小体积容量孔经常产生操作上的困难，这可以部分通过‘活芯片（livingchip）’技术来克服。这种技术组合了高密度微矩阵和微孔基础的分析形式。‘活芯片’通过液体表面张力的作用支撑液体，组成一个50纳升通道（每个芯片10000个通道）的二维矩阵。大量的化学、生化或基于细胞的微量反应通过BL/CL影像技术平行监测。图3.微孔板上的生物和化学发光(BL/CL)。基于超灵敏的光电耦荷装置（CCD）的成像系统，可以同时测量整个384孔板的BL/CL信号。其中每个孔的信号都会通过对BL/CL数字图象进行软件分析得到精确的定量。通过对直观可视信号的评估，测量得到的BL/CL光信号会被转变成假色，而更加突出不同的光强度，如图所显示。BL/CL成像弱光成像设备是基于超高灵敏度的CCD相机可以检测到由样品表面发生特定的反应后发射出来的光。这些设备不但可以在单分子水平定量发光的强弱，还可以进行定位。[31,32]他们可以用来分析大样品，比如凝胶、膜、微孔板，培养皿、整个器官或活体动物，其空间解析度（BL/CL信号）可达100-200mm。而通过与光学显微镜的配合，他们还可以用来分析微样品，比如组织切片、单细胞或者微芯片设备，其空间解析度高达0.4mm。虽然保持了高度的检测能力，但是通过选择合适的光学系统可以将光损失最小化。组织切片和单细胞原位CL(化学发光)杂交检测方法是基于标记的寡核苷酸探针与目标核酸序列特异性原位杂交，再进行CL检测。这种方法不但可以定位还可以定量检测在细胞或组织中目标序列的数量。目前已发展了数种可以在组织或细胞中单检测或双检测病毒核酸的CL原位杂交方法。[33]如图Figure4在人皮肤组织样本中检测人乳突淋瘤病毒（HPV）。CL显微镜成像比比色或荧光检测技术具有更高的灵敏度，其表现甚至超过同位素。因此，CL检测目前已经成为可以对传染病或其他遗传、癌症等疾病快速早期诊断强有力的工具。Exvivo全组织作为一种简单而可靠的模式，分离并灌注器官被广泛的应用在各种生物学功能的研究方面。BL/CL成像已经被应用到病生理过程的exvivo研究中。氧自由基（OFR）相关氧化过程藕耦连而自发产生微弱的光子。超低的发光与增强化学发光，目前已经广泛的应用于研究整体器官氧自由基的形成。目前已发展出一套实时定量的CL成像方法，可以检测分离和灌注鼠肝脏中由于缺血灌注而造成的氧化损伤，[34]并通过研究第一次揭示了鼠肝脏表面的超氧自由基的空间分布和特异性脱氧剂的作用。光子在穿透过组织时，会发生光的吸收和散射，以及其他光学现象。为了获得准确可靠的数据，必须考虑到这些因素。体内全动物BL/CL反应所产生的可见光可以部分的透过动物组织，因此可以在整体动物的模式下进行成像。BL全体细胞和分子成像作为一种灵敏、可定量、非侵入性的和实时的方法，可以用来对活体动物进行生物学研究，并将对生物技术、分子医学、基因治疗和药物研发等领域产生深远的影响。图4.化学发光（CL）原位杂交。使用特异性的地高辛标记基因探针在一个皮肤组织切片中检测到了人乳突淋瘤病毒（HPV）DNA。地高辛抗体会与碱性磷酸酯酶和C